Экстрасинаптическая секреция нейротрансмиттеров: исследование с помощью изолированного нейрона как биологического сенсора

• Автор: Чистопольский, Илья Александрович
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 75 с. : ил.

Оглавление.
1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Положения, выносимые на защиту

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭКСТРАСИНАПТИЧЕСКАЯ ПЕРЕДАЧА В ПРОСТЫХ НЕРВНЫХ СИСТЕМАХ

2.1. Современные представления об экстрасинаптической передаче (УТ)

2.1.1. Модели

2.1.2. Характеристика УТ и сравнение ее с УТ

2.2. Медиаторные системы простых нервных сетей
2.2.1. Малые молекулы
2.2.2. Макромолекулы (полипептиды)
2.2.3. Классические медиаторы
2.3. Методы исследования экстрасинаптической секреции медиаторов в простых нервных системах
2.3.1. Соматическая секреция
2.3.2. Прямые способы обнаружения соматического выброса
2.3.3. Регистрация соматического выброса
2.4. Предваряющие исследование замечания
3. МЕТОДЫ
3.1. Биосенсор
3.2. «Полуизолированные» нейроны А-кластера
3.3. Тестируемые ганглии ЦНС
3.4. Условия экспериментов, обработка полученных данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Медиаторная обстановка вблизи серотонинергических нейронов A-кластера педальных ганглиев
4.1.1. Предварительное исследование механизма действия 5-НТР на нейроны A-кластера педальных ганглиев
4.1.2. 5-НТ в межклеточном пространстве педальных ганглиев
4.1.2.1. Изменение активности изолированного нейрона
вблизи ЦНС и 5-НТ капилляра
4.1.2.2. Косвенная идентификация медиаторных молекул
педальных ганглиев
4.1.3. Мсдиаторный «бульон» педальных ганглиев
4.1.3.1. Неизвестной деполяризующий (сужающий) химический фактор
4.1.3.2. Неизвестный гиперполяризующий
(тормозящий) химический фактор
4.2. Медиаторная обстановка вблизи буккальных ганглиев
4.2.1. Исследование медиаторной обстановки в буккальных
ганглиях во время работы генератора пищевого ритма
4.2.2. Исследование медиагорной обстановки в букальных ганглиях при
активации CGC, нейронов, управляющих генератором пищевого ритма
4.3. Итоги проделанных экспериментов
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Механизмы VT типа в педальных ганглиях моллюска
5.1.1. Роль 5-НТ
5.1.2. Медиаторы межклеточного пространства педального ганглия
5.2. Медиаторная обстановка в буккальных ганглиях моллюска
5.2.1. Функция медиаторных колебаний в буккальных ганглиях
5.2.2. Амплитуда медиаторных колебаний в буккальных ганглиях
5.2.3. CGC - классическая модель управления нейронным ансамблем?
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
литература

1. ВВЕДЕНИЕ.
1.1. Актуальность проблемы.
В конце 19 столетия исследования клеточной структуры нервной ткани позволили ставить вопросы о природе механизмов нервных систем. Предположения об основных принципах организации нервной системы животных опирались уже в большей степени на опыт, чем на умозрительные доводы, как было до этого. Первоначальные разумные представления о том, что нервная ткань это непрерывная среда, которая приспособлена для передачи возбуждения по проводящим волокнам, постепенно замещались представлениями о том, что нервная сеть устроена по типу связанных между собой, но отдельных, относительно независимых элементов. Тон в исследованиях задавали методические подходы нейроанатомов. Методы окрашивания отдельных нейронов позволили выдвинуть несколько гипотез об их способах связи внутри нервной системы. Делались попытки обобщить принципы нервного возбуждения и торможения на работу всей нервной системы животного, при этом исследования проводились, в основном, на протяженных нервах, связывающих ЦНС (центральная нервная система) и мышцы-эффекторы.
Наиболее ранняя, обоснованная анатомическими данными трактовка передачи сигналов внутри ЦНС связана с именем К. Гольджи [22]. Его представление о передаче возбуждения от одного нейрона другому предполагало потерю индивидуальных свойств нейронов и ставило во главу угла пространство «диффузной сети». Гольджи разумно полагал, что любая адресная передача электрического сигнала с одной клетки на другую необходимо столкнется с шунтированием низкоомным внешним раствором. Его трактовка работы такой диффузной сети, приводила необходимо к выводу о том, что окончания нейронов, создающих такую сеть, не имеют упорядоченной структуры и образуют нечто сходное с тем, что мы теперь называем синцитием. Возбуждение распространяется в такой ткани безадресно, т.е. на все нейриты, расположенные вблизи источника таких сигналов. Из всего этого также следовало, что вклад одного нейрона в реализацию функции всей ЦНС будет ничтожным. Сеть нейронов представлялась Гольджи как состоящая из нескольких пластов, каждый из которых содержит или тела (сомы) нейронов или же их нейриты. Такая модель хорошо согласовывалась с его анатомическими представлениями о нервной системе.
С представлением о диффузной сети конкурировало представление о нервной системе как о цепочках связанных друг с другом нейронов. Сформулировал его испанский

был закрыт для предотвращения испарения. Сближения изолированного нейрона с таким 5-НТ капилляром, проводили попеременно, несколько раз в каждом эксперименте.
Используемые для действия на нейроны экзогенные химические вещества добавляли в проток или вносили в камеру микропипеткой. Использовали вещества: хинин (Calbiochem), серотонин (5-гидрокси-Ь-триптамин, 5-НТ, Sigma), метаболический предшественник серотонина (5-гидрокси-Ь-триптофан, 5-НТР, Sigma).
Для ингибирования триптофандекарбоксилазы, фермента, превращающего 5-НТР в 5-НТ, применяли м-гидроксибензилгидразин (мГБ, Sigma).
Для отслеживания динамики ответа клеток на действие веществ, проводили специальную организацию измерений во времени. Длительность непрерывной записи электрической активности, на которой усреднялись измеряемые параметры, составляла 0,5-2 минуты. Интервал между окончанием предыдущей и началом следующей такой записи, составляющий несколько минут, выбирался достаточным, чтобы получить средние параметры фона на нем. После расчета средних значений параметров, достоверность полученных результатов оценивали по непараметрическому критерию Уилкоксона и критерию знака, в части случаев пользовались F-критерием [11],[19]. Данные о количестве опытов в конкретных сериях экспериментов даны в соответствующих разделах Результатов.
Для нахождения значимых корреляций между двумя записями электрических активностей нейронов (п.4.2.1.) предварительно обрабатывали полученные треки мембранных потенциалов, усредняя их значения по времени. В случае наличия спайков усреднение проводили по частоте спайков, при отсутствии спайков - усредняли мембранный потенциал. После процедуры усреднения выделяли локальные максимальные значения на полученных кривых и отмечали их текущие значения времени. Далее полученные значения использовали для выявления связи между различными треками.
Основной смысл процедуры был в следующем. Выбирали на одном из треков локальный максимум и находили наиболее близкий по текущему значению времени локальный максимум на другом треке. После этого вычисляли разницу между этими текущими значениями времени. Далее проводили подобную процедуру для всех значений локальных максимумов этих двух треков. Для двух сравниваемых треков получали некоторый набор чисел (далее - «разности времени»). Далее проводили такую попарную процедуру как для треков из разных файлов (т.е. там, где заведомо не было корреляций между треками), так и для треков из одного и того же файла, где корреляция могла быть. Идея заключается в том, что в случае, если между парой треков существует корреляция, функция распределения значений «разностей времени» для них будет' отлична от