Генетический анализ систем токсин-антитоксин суперсемейства RelBE у лактобацилл

• Автор: Климина, Ксения Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 190 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Общее представление о бактериях рода Lactobacillus

1.2 ТА системы: общая характеристика и классификация

1.3 Механизм действия и биомишени токсинов ТА систем

1.4 Функции ТА систем

1.5 Области применения ТА систем

1.6 Разнообразие ТА систем II типа

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы и условия культивирования
2.2 Выделение ДНК
2.3 Конструирование праймеров и проведение ПЦР
2.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из геля
2.5 Секвенирование ДНК
2.6 Биоинформатический анализ ...;
2.7 Клонирование генов ТА систем в экспрессионные векторы
2.8 Определение активности ТА систем в клетках E.coli
2.9 Выделение РНК
2.10 Обратная транскрипция
2.11 Количественная ПЦР в режиме реального времени
2.12 Удлинение праймера (Primer extention)
2.13 Определение точки начала транскрипции при помощи специфической амплификации концевых фрагментов кДНК (RLM-RACE)
2.14 Создание IacZ-транскрипцнонных конструкций (fusions) и определение функционирования промоторов по активности Р-галактозидазы в клетках B.subtilis.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Видовая идентификация штаммов лактобацилл из лабораторной коллекции
3.2 Биоинформатический поиск и структура модулей ТА систем суперсемейства RelBE типа в секвенированных геномах лактобацилл
3.3 Изучение полиморфизма генов суперсемейсгва RelBE
3.3.1 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE в штаммах L.rhamnosus.

3.3.2 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE в штаммах L.casei.
3.3.3 Изучение полиморфизма генов суперсемейства RelBE в штаммах L.helveticus
3.4 Изучение функционирования ТА систем лактобацилл в клетках E.coli
3.4.1 Клонирование и экспрессия в клетках E.coli ТА генов L.rhamnosus
3.4.2 Клонирование и экспрессия в клетках E.coli ТА генов L.helveticus
3.4.3 Клонирование и экспрессия в клетках E.coli гена токсина L.casei
3.5 Изучение регуляции экспрессии ТА системы YefM-YoeB у штаммов L.rhamnosus
3.5.1 Особенности проксимального и дистального районов ТА системы YefM-YoeBLrh
3.5.2 Идентификация сайтов инициации транскрипции в ТА системе YefM-YoeBLrh
3.5.3 Исследование активности предполагаемых промоторов
3.5.4 Изучение транскрипционной активности генов уеіМ-уоеВщ, в стрессовых условиях методом RTq PCR
3.6 Поиск и характеристика новых ТА систем у L.helveticus
3.6.1 Поиск новых ТА систем в секвенированных геномах L.helveticus
3.6.2 Идентификация и полиморфизм новых ТА систем в штаммах L.helveticus из лабораторной коллекции
3.6.3 Клонирование и экспрессия в клетках E.coli генов новых ТА систем L.helveticus
3.7 Системы ТА суперсемейства RelBE как биомаркеры для идентификации штаммов лактобацилл
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение А
Приложение Б
Приложение В
Приложение Г
Приложение Д
БЛАГОДАРНОСТИ
ВЕДЕНИЕ
Исследование микробиоты человека является одним из быстро развивающихся направлений системной биомедицины [Nicholson J.K. et al., 2012; Kelsen J.R. et al., 2012]. Микробиота кишечника трактуется в настоящее время как сателлитный орган, играющий важную роль в становлении и поддержании иммунитета и общего гомеостаза человека, в том числе его нервно-психических и поведенческих особенностей [Flint H J. et al., 2012; Foster J.A. et al., 2013]. Композиция пробиотической составляющей кишечной микробиоты (бифидобактерии и лактобациллы) является важнейшим показателем состояния постулируемого органа [Turroni F. et al., 2014]. Длительное нарушение микробного баланса кишечника в сторону снижения количества бифидобактерий и лактобацилл играет значительную роль в развитии ослабленного иммунитета, аллергии и метаболического синдрома, отягощая их течение, и коррелирует с проявлением различных заболеваний: гастроэнтерологических, иммунных, кардиологических, онкологических, нейродегенеративных [Young V.B. et al., 2012, Moloney R.D. et al., 2014]. Видовое и штаммовое разнообразие пробиотических бактерий здоровых людей носит индивидуальный (возраст, образ жизни), этно-социалъный (традиции питания) и региональный (популяция) характер. Таким образом, для исследования и мониторинга состояния «сателлитного органа» требуется разработка новых подходов и технологий. В последние годы для этих целей применяют методы метагеномного анализа с использованием секвенаторов нового поколения. Вместе с тем, серьезной проблемой при изучении микробиома человека является отсутствие эффективных генов-биомаркеров для видовой и штаммовой идентификации бактериальных компонентов. Разработка таких маркеров и технологий для диагностики состава микробиоты человека является актуальным вопросом для прикладных (диагностических) исследований общей и персонализированной медицины.
Мы предлагаем использовать для видовой и штаммовой идентификации лактобацилл новый генетический маркер - гены систем токсин-антитоксин (ТА) П типа. Подавляющее большинство генов ТА систем видоспецифичны. Предложенный нами метод видовой и штаммовой идентификации может быть использован как для характеристики отдельных штаммов, так и для характеристики сообщества микроорганизмов, например в микробиоте человека.
ТА системы - это генетические элементы, состоящие из 2-х, реже 3-х генов. Продукты генов токсинов всех известных ТА систем - это белки, в то время как антитоксины - это либо белки, либо некодирующие РНК. ТА системы и их компоненты

специфические черты рибосомо-зависимых нуклеаз [Kamada K. et al., 2005; Feng S. et al., 2013]. Экспрессия токсина YoeB из S. pneumoniae была детальна в клетках Arabidopsis thaliana. Это был первый пример действия бактериальных ТА систем на растения [Abu Bakar F. et al., 2015].
ТА системы присутствуют у разных видов бактерий микробиома человека, в частности система RelBE, была обнаружена у некоторых представителей миктобиоты человека (таблица 4).
Таблица 4. ТА системы у бактерий микробиомы челорвека.
Семейство Вид Количество ТА систем суперсемейства RelBE’
Actinobacteria Bifidobacterium от 1 до
Corinebacterium -
Propionibacterium -
Bacteroidetes Bacteroides от 1 до
Parabacteroides
Prevotella -
Firmicutes Bacillus от 1 до
Clostridium от 1 до
Enterococcus
Eubacterium от 1 до
Lactobacillus от 1 до
Listeria
Streptococcus от 1 до
Fusobacteria Fusobacterium
Proteobacteria Citobacter от 1 до
Escherichia от 1 до
Enterobacter от 3-х до
Helicobacter от 1 до
Klebsiella от 1 до
Pseudomonas от 1 до
• данные по базе данных TADB fhttD://biomfo-mml situ.edu.cn/TADB/