Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз на модели трансгенных растений табака : Nicotiana tabacum L.

• Автор: Сангаев, Содном Сергеевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Системы неспецифической защиты растений от патогенов
1.1.1. Система распознавания патогенов
1.1.2. Системная приобретенная устойчивость (SAR)
1.1.3. Индуцируемые белки, связанные с защитой
1.1.4. Белки, индуцируемые при поранении растений
1.2. Секреторные рибонуклеазы растений
1.2.1. Роль S-РНКаз в генерации гаметофитной самонесовместимости
1.2.2. S-подобные РНКазы
1.3. Способы повышения вирусоустойчивости растений с помощью трансгенеза.
1.3.1. Устойчивость патогенного происхождения
1.3.2. Устойчивость непатогенного происхождения
Заключение по обзору литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Растительный материал
2.1.2. Бактериальные штаммы
2.1.3. Плазмиды
2.1.4. Реактивы
2.1.5. Ферменты
2.1.6. Праймеры
2.1.7. Среды и буферные растворы
2.2. Методы
2.2.1. Генно-инженерные работы
2.2.2. Получение трансгенных растений табака
2.2.3. Молекулярно-генетический анализ трансформантов
2.2.4. Физиолого-биохимический анализ трансформантов
2.2.5. Компьютерная обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Создание генетических конструкций
3.1.1. Выбор генов для создания конструкций
3.1.2. Конструирование плазмиды рВыКИБ
3.1.3. Конструирование плазмиды рВКИк
3.2. Получение трансформантов табака
3.3. Измерение РНКазной активности у полученных трансформантов
3.3.1. Измерение РНКазной активности в грубых листовых экстрактах
3.3.2. Измерение РНКазной активности в смывах апопластной жидкости
3.4. Анализ спектра белков с РНКазной активностью в грубых экстрактах
3.5. Молекулярно-генетический анализ трансформантов и получение гомозигот по инсерции трансгена
3-5.1- Оценка копийиости трансгенов с помощью Саузерн-блот гибридизации
3.5.2. Сегрегационный анализ и оценка стабильности наследования трансгенных конструкций
3.6. Сравнительный морфометрический анализ контрольных и трансгенных растений
3.7. Оценка устойчивости трансгенных растений к вирусу табачной мозаики..
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АИК - активные интермедиаты кислорода,
БСА - бычий сывороточный альбумин,
ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты,
ВТМ - вирус табачной мозаики,
е.а. - единица активности,
мРНК - матричная РНК,
кДНК - комплементарная ДНК,
o.e. - оптическая единица,
ОТ - обратная транскрипция,
п.н. - пары нуклеотидов,
ПНР - полимеразная цепная реакция,
РІЖ - рибонуклеиновая кислота,
РНКаза - рибонуклеаза,
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота,
ЭР - эндоплазматический ретикулум,
ELISA - иммуноферментный анализ,
GUS - ß-глюкуронидаза,
ISR - индуцированная системная устойчивость,
LAR - локальная приобретенная устойчивость,
NPTII - неомицинфосфотрансфераза II,
РАМР — патоген- ассоциированные молекулярные паттерны,
PDR — устойчивость патогенного происхождения,
PR-белок - патогенез - ассоциированный белок,
RIP — белок, инактивирующий рибосомы,
SAR - системная приобретенная устойчивость,
SDS — лаурилсульфат натрия.

(Van Nerum et al., 2000; Ma and Oliveira, 2000). У Nicotiana tabacum обнаружены гены трех S-подобных РНКаз (Nkl, Nk2 и Nk3), одна из которых (Nkl), предположительно, является экстраклеточной (Ohno and Ehara, 2005). Кроме того, у табака обнаружена экстраклеточная РНКаза, почти идентичная РНКазе Nkl и полностью идентичная РНКазе NE Nicotiana alata (Galiana et al., 1997). У Nicotiana glutinosa описаны РНКазы NW, NGR2 и NGR3 (Kariu et al., 1998; Kurata et al., 2002). РНКаза NW считается экстраклеточной (Kariu et al., 1998). РНКаза NGR3 несет на своем С-конце сигнал заякоривания в ЭР, что указывает на ее внутриклеточную локализацию (Lehmann et al., 2001; Kurata et al., 2002).
Как правило, по аминокислотной последовательности S-подобные РНКазы одного растения более схожи с соответствующими РНКазами других видов растений, чем друг с другом (Dodds et al., 1996; Ma and Oliveira, 2000; Kurata et al., 2002). РНКазы NW Nicotiana glutinosa, NE Nicotiana alata и Nkl Nicotiana tabacum имеют очень высокую степень гомологии (более 96% во всех случаях). При этом сходство РНКазы NW с РНКазами NGR2 и NGR3 составляет 33% и 58%, соответственно (Kurata et al., 2002). Сравнение аминокислотных последовательностей показывает, что S-подобные РНКазы разных видов образуют межвидовые группы (Ma and Oliveira, 2000; Kurata et al., 2002). Такое межвидовое группирование S-подобных РНКаз указывает на то, что в пределах группы эти РНКазы имеют сходные функции (Kurata et al., 2002).
В нормальных условиях экспрессия некоторых S-подобных РНКаз является органоспецифичной или связана с определенной стадией развития. Например, РНКаза NE Nicotiana alata при нормальных условиях экспрессируется в некоторых органах цветка, но не экспрессируется в листьях, корнях и стеблях (Dodds et al., 1996). РНКаза RNS1 Arabidopsis thaliana экспрессируется в цветках, но почти не детектируется в других органах. Экспрессия РНКаз RNS3 арабидопсиса и ZRNasel циннии наблюдается в