Создание геномной ВАС библиотеки Allium fistulosum L. и ее использование в молекулярно-цитогенетических исследованиях

• Автор: Киселева, Анна Витальевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Конструирование библиотек бактериальных искусственных хромосом (ВАС) растений

1.1.1. Выделение высокомолекулярной ДНК

1.1.2. Системы для клонирования больших фрагментов ДНК

1.1.3. ВАС векторы

1.1.4. Отбор рекомбинантных клонов

1.1.5. Скрининг ВАС библиотеки с ДНК зондами

1.2. Общая характеристика А. Азш1озит

1.3. Геном А./stulosum Б
1. 4. Субтеломерный гетерохроматин
1.4.1. Структура и функция субтеломерного хроматина
1.4.2. Особенности организации субтеломерного гетерохроматина у луковых
1.5. Теломеры
1.5.1. Структура и функция теломер
1.5.2. Особенности организации теломеры у луковых
1.6. Молекулярная организация растительной центромеры
1.6.1. Центромерный сателлитный повтор у растений
1.6.2. Центромерные ретротранспозоны
1.6.3. Организация центромерного региона у луковых

1.7. ВАС библиотеки в геномных исследованиях и молекулярной цитогенентике
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растительный материал
2.2. Конструирование ВАС библиотеки
2.2.1. Выделение высокомолекулярной ДНК
2.2.2. Запаивание ядер в агарозных слайсах
2.2.3. Очистка высокомолекулярной ДНК в агарозных слайсах
2.2.4. Определение оптимальных условий для частичной рестрикции
2.2.5. Отбор рестрицированных фрагментов для дальнейшего клонирования
2.2.6. Лигирование отобранной ДНК с вектором ВАС
2.2.7. Трансформация лигированной ДНК в клетки E. coli DH10B электропорацией
2.3. Выделение геномной ДНК
2.4. Создание ДНК-зондов
2.4.1. Приготовление Cot-1 фракции ДНК
2.4.2. Биоинформационный поиск в генетических базах данных
2.5. Скрининг ВАС библиотеки
2.5.1. Скрининг ВАС библиотеки с помощью полимеразной цепной реакции
2.5.2. Скрининг ВАС библиотеки с помощью дот-блот гибридизации
2.6. Секвенирование ВАС клонов
2.6.1. Концевое секвенирование

2.6.2. Полное секвенирование
2.7. Анализ нуклеотидных последовательностей
2.8. Выделение плазмидной ДНК
2.9. Приготовление препаратов митотических хромосом
2.10. Приготовление ДНК-пробы
2.11. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)
2.12. Микроскопия и анализ изображения
2.13. Кариотипирование
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание ВАС библиотеки A. fistulosum
3.2. Скрининг ВАС библиотеки A. fistulosum на субтеломерную последовательность
3.2.1. Концевое секвенирование и биоинформационный анализ ВАС клонов, несущих субтеломерную последовательность
3.2.2. FISH анализ ВАС клонов, несущих субтеломерную последовательность
3.3. Скрининг ВАС библиотеки A. fistulosum на видоспецифичные последовательности
3.3.1. ВАС клон с видоспецифичной субтеломерной последовательностью
3.3.1.1. ВАС- FISH клона 5.12.
3.3.1.2. Секвенирование ВАС клона 5.12.7, сборка контигов, аннотирование
3.3.1.3. Поиск и геномная организация повторяющихся последовательностей
3.3.2. ВАС клон с прицентромерной локализацией

В растительных центромерах наиболее часто встречаются как сателлитная ДНК, так и центромерные ретротранспозоны, которые связаны с CENH3, центромер-специфичным гистоном НЗ, присутствующим в нуклеосомах активных центромер (Cheng et al., 2002; Jiang et al., 1996a; Miller et al., 1998a; Nagaki et al., 2003b, 2004; Presting et al., 1998; Zhong et al., 2002). Центромерные сателлитные последовательности ДНК были выделены у нескольких видов растений, в том числе: Arabidopsis (Round et al., 1997), кукуруза (Ananiev et al. 1998), сорго (Miller et al., 1998a), рис (Cheng et al., 2002; Zhang, Huang et al., 2004; Lee et al., 2005), Medicago truncatual (Kulikova et al., 2004), Brassica (Lim et al., 2007) и соя (Тек et al.. 20j_0). В отличие от
-центромер—большинства видов растений, у которых функциональные центромеры в основном состоят из больших массивов центромерных сателлитных повторов и центромер-специфиных ретротранспозонов (Jiang et al., 2003), в центромере пшеницы отсутствуют тандемные сателлитные повторы, размером в млн.п.н., а преобладают центромерные ретротранспозоны (Liu et al., 2008; Li et al., 2013).
1.6.2. Центромерные ретротранспозоны
В геномах всех эукариот содержатся ретротранспозоны, представляющие собой класс мобильных ДНК элементов, которые используют РНК-интермедиат для своего встраивания в геном с помощью обратной транскиптазы (Deininger, Batzer, 2002; Hirochika, Hirochika, 1993; Kumekawa et al., 1999; Suoniemi et al., 1998; Wostemeyer, Kreibich, 2002). Ретротранспозоны делятся на две большие группы, вирусные и невирусные. Для вирусных ретротранспозонов характерно наличие длинного терминального повтора (long terminal repeat, LTR), который фланкирует протеин-кодирующий регион. Благодаря репликативному типу
транспозиции на основе РНК-интермедиата, ретротранспозоны составляют большую часть ДНК многих эукариотических геномов. Они особенно