Изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и их инфицированности РНК-содержащими вирусами с помощью молекулярно-генетических методов

• Автор: Калашников, Александр Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 245 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Популяции пчел в России и СНГ

1.2. Смешение подвидов медоносных пчел

1.3. Морфометрический анализ популяций пчел

1.4. Исследование популяций пчел при помощи анализа митохондриального и ядерного геномов пчел

1.5 РНК-СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУСЫ ПЧЕЛ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.2. Методы исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Морфометрический анализ пчел
3.2. Анализ породной принадлежности пчел при помощи полиморфизма мтДНК
3.3. Анализ ядерного генома пчел при помощи микросателлитных маркеров
3.3.1. Дифференциагрш пород пчел по микросателлитным маркерам
3.3.2. Дифференциация популяций пчел по микросателлитным маркерам
3.3.3. Дифференциация семей пчел по микросателлитным маркерам
3.3.4. Различие в дифференциации популяций по микросателлитным маркерам с учетом особенностей структуры пчелиной семьи
3.4. Анализ распространения РНК-содержащих вирусов пчел
3.4.1. Анализ нуклеотидной последовательности вируса деформации крыла (01¥У) пчел
3.4.2. Анализ нуклеотидной последовательности вируса мешотчатого расплода (ЭВУ) пчел
3.4.3. Анализ нуклеотидной последовательности вируса черных маточников (BQCV) пчел
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
дцРНК, двухцепочечная РНК КИ- кубитальный индекс мтДНК- митохондриальная ДНК МС- микросателлиты
оцРНК- одноцепочечная рибонуклеиновая кислота
ОТ-ПЦР (RT-PCR)- двухстадийная реакция обратной транскрипции с последующим ПЦР полученной кДНК ПЦР- полимеразная цепная реакция
ПЦР-ПДРФ мтДНК - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов РИД- реакция иммунодиффузии
ABPV- acute bee paralysis virus, вирус острого паралича пчел
BQCV- black queen cell virus, вирус черных маточников пчел
CBPV- chronic bee paralysis virus, вирус хронического паралича пчел
CCD- collapse colony disorder, коллапс колоний
DWV- deforming wing virus, вирус деформации крыла
IAPV- Israel acute paralysis virus, Израильский вирус острого паралича
IFV- infectious flacherie virus, инфекционный вирус шелковичного червя
IIV-6, invertebrate iridescent virus type 6, радужный вирус беспозв. 6 типа
KBV- Kasmir bee virus, Кашмирский вирус пчел
KV, Kakugo virus, вирус Какуго
ORF, open reading frames, открытая рамка считывания (транскрипции) RNAz- RNA interference, интерференция РНК
SNP- single nucleotide polymorphism, полиморфизм однонуклеотидных замен.
SBV- sacbrood bee virus, вирус мешотчатого расплода пчел SPV- (slow paralysis virus), вирус медленного паралича UTR- untranslated region, нетранслируемая область Varroa destructor virus (VDV-1), вирус Varroa destructor 1 типа

Актуальность исследований. На территории России наиболее распространены карпатская, серая горная кавказская, среднерусская порода медоносной пчелы Apis mellifera и породный тип “Приокский”, выведенный в результате скрещивания пчел среднерусской и серой горной кавказской породы. Среднерусская порода относится к подвиду темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. [1, 53], характеризуется уникальным комплексом черт, включая зимостойкость и устойчивость к инфекциям и служит исходным материалом при создании промышленных пород.
В отдельных регионах произошла гибридизация темной лесной пчелы А. т. mellifera L с южными породами, относящимися к подвидам А. т. carnica, А. т. liguistica и А. т. caucasica [8, 54, 68]. Интрогрессия южных пород пчел в популяции среднерусской пчелы приводит к ухудшению производственных качеств и меньшей устойчивости к суровым природным условиям гибридных популяций пчел, а также к снижению иммунитета, что способствует распространению инфекционных заболеваний [106] и к сокращению генетического разнообразия популяций пчел [260].
Для сохранения аборигенных пород пчел необходимо дополнительно к морфометрическому методу [2, 7] использовать современные методы анализа генетических ресурсов: анализ мтДНК [28,53, 242] и микросателлитных локу-сов [21, 52, 141]. В соответствии с Федеральным законом о племенном животноводстве и рекомендациями Комиссии по биологии пчелы и конгресса “APIMONDIA”
Для предотвращения сокращения численности популяций пчел вследствие распространения вирусных заболеваний необходима профилактика заражения клещом Varroa destructor, который служит переносчиком вирусов, и контроль

показано с VDV-1. Предполагается, что клиническими проявлениями у KV являлись увеличение брюшка и агрессивность, а у DWV в добавление (!) к этому деформация крыльев [258].
Ранее идентифицированный KV, который получен из мозговой ткани пчел, нападающих на гигантского шершня, обнаружен в тканях мозга клинических образцов пчел в области грибовидного тела, тельцах Пачинни и тканях глазного нерва, а также в других тканях: в гипофарингальных железах и жировом теле, что указывало на системность инфекции. У пчел выявлен новый ген, кодирующий белок, напоминающий мотив лейциновой молнии, который экспрессировался на периферии тканей мозга. Экспрессию этого белка наблюдали при инфицировании KV, в чистом виде подобный белок находили в геноме паразитарной осы Nasonia и не находили в геномах других насекомых. Вирус KV может клинически проявляться в виде нарушений функций мозга и других физиологических состояний у пчел [155].
В носителе V. destructor могли образовываться и преобладать рекомбинанты между DWV и VDV-1. Рекомбинанты накапливались в большом количестве при развитии вируса. Как показали исследования при помощи фраг-ментного секвенирования Illumina, в индивидуальных личинках пчел также обнаружена смесь рекомбинантов вирусов. Рекомбинация происходила в 5-UTR и кодирующей полипептиды капсида областях, так и области, кодирующей неструктурные полипептиды вируса, улучшая, таким образом, адаптацию вирусов к новому хозяину при уровне вирусной нагрузки до 105 ГЭ [195].
Различие генеалогических признаков среди вирусов одного и того же вида может быть связано с ретротранпозицией в различных локусах различных штаммов. Отдельные дисперсии могут происходить за счет интеграции не-ретровирусной РНК в геном хозяина с помощью рекомбинации РНК с последующей ретротранспозицией. У 30% особей Apis mellifera в геноме был обнаружен сегментDicistrovinis. [193, 194].