Характеристика нового нехромосомного детерминанта [NSI+]дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Нижников, Антон Александрович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ПРИОНЫ ВЫСШИХ И НИЗШИХ ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Структурные особенности и биогенез прионов: проблема инфекционности

1.1.1 Особенности организации амилоидных белковых полимеров

1.1.2 Функциональная и патогенная роль некоторых неинфекционных амилоидов

1.1.3 Инфекционность и репликация прионов

1.2 Прионы высших организмов

1.2.1 Прион млекопитающих РгР

1.2.2 MAVS: функциональный амилоид или новый прион человека?

1.2.3 Белок СРЕВ моллюска Aplysia californica демонстрирует прионные свойства в гетерологичной системе
1.3 Прионы аскомицетов
1.3.1 [Het-s] - прионный детерминант Podospora anserina
1.3.2 Прионные детерминанты S. cerevisiae
1.3.2.1 Прионные детерминанты [РЗУ] и [URE3], критерии дрожжевых прионов Р. Викнера
1.3.2.2 Детерминант [P/У] и дрожжевые прионы, выявленные в связи с его изучением
1.3.2.2.1 Идентификация [Р/У]
1.3.2.2.2 Детерминант [SJVf]
1.3.2.2.3 Детерминант [ОСУ] как прионная изоформа белка Сус8
1.3.2.2.4 Прионные свойства NQ-обогащенного домена белка Newl
1.3.2.2.5 Детерминант [MOD+]
1.3.2.3 Прионный детерминант [МОТЗ+]: использование МС доменов белка Sup35 для идентификации новых прионов

1.3.2.4 Прионный детерминант [ISP ]
1.3.2.5 Прионные свойства компонентов ядерного порового комплекса S. cerevisiae: приоиоподобный детерминант [NUP100+]
1.3.2.6 ß] и [GAR+] как пример инфекционных белковых детерминантов, не обладающих амилоидными свойствами
1.3.2.7 Возможная биологическая роль прионов: конфликт восприятия прионов как патогенов или адаптивных факторов
1.3.2.8 Поиски новых прионных детерминантов Saccharomyces cerevisiae
1.3.2.8.1 Анализ аминокислотной композиции как инструмент предсказания прионных и амилоидных свойств белков
1.3.2.8.2 Экспериментальные способы поиска прионов
1.3.2.9 Наследственные факторы 5. cerevisiae, для которых не установлен ген-детерминант
1.3.2.9.1 Нехромосомный детерминант [MS/]
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования
2.2 Плазмиды
2.2.1 Описание плазмид, полученных в работе
2.3 Генетические методы
2.4 Молекулярно-биологические методы
2.4.1 Белковая трансформация
2.5 Флуоресцентная микроскопия
2.6 Статистический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Анализ особенностей фенотипического проявления [.MS/"]
3.1.1 Изучение зависимости нонсенс-супрессии в штаммах [MS/] от первичной последовательности и уровня экспрессии гена SUP35
3.1.2 Изучение взаимосвязи нонсенс-супрессии в штаммах [MS/] и эффективности трансляции
3.1.3 Анализ влияния [MS/"] на вегетативный рост дрожжей

3.2 Характеристика прионных свойств [MS'/]
3.2.1 Демонстрация инфекционных свойств [MS'/] при помощи белковой трансформации
3.2.2 Изучение спонтанного возникновения [MS/] de novo
3.2.3 Исследование наследования детерминанта [MS/] при помощи тетрадного анализа
3.3 Анализ взаимодействия [MS/] с генами, кодирующими ранее идентифицированные прионы дрожжей
3.3.1 Проверка влияния на [MS/] делеции или сверхэкспрессии генов, кодирующих ранее идентифицированные прионы S. cerevisiae
3.3.2 Изучение взаимодействия [MS/] с детерминантом [Р/М4-]
3.4 Поиск генов, сверхэкспрессия которых маскирует фенотипическое проявление [MS/]
3.4.1 Геномный скрининг в штамме [MS/]
3.4.2 Анализ влияния гена SUP45 на нонсенс-супрессию в штаммах [MS/]
3.4.3 Изучение эффектов сверхэкспрессии NQ-обогащенных транскрипционных факторов гена SUP45 в штаммах [тш"]
3.5 Выявление генов, сверхэкспрессия которых сходна по фенотипическому проявлению с [MS/]
3.5.1 Геномный скрининг в штамме [шГ]
3.5.2 Изучение влияния на нонсенс-супрессию сверхэкспрессии или делеции генов, кодирующих NQ-обогащенные белки, выявленных в ходе скрининга
3.5.3 Анализ эффектов сверхэкспрессии и делеции гена VTS1
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Детерминант [MSM] обладает свойствами дрожжевого приона
4.2 Проявление нонсенс-супрессии в штаммах [MS/] зависит от генов, кодирующих факторы терминации трансляции
4.3 Влияние детерминанта [PIbf] на проявление [MS/] как пример взаимодействия между дрожжевыми прионами

Lindquist, 2000]. Проверка показала, что именно RNQ1 необходим для поддержания [PIN*], и белок Rnql находится в агрегированном состоянии в [PIN] штаммах. Таким образом, было установлено, что [PIN*] является прионной изоформой Rnql. Белок Rnql не был выявлен в ходе скрининга, так как его сверхпродукция не приводит к значительному увеличению частоты индукции [PIN*] [Derkatch et al. 2001]. Функция Rnql неясна. Показано, что деления гена RNQ1 приводит к формированию восьмиспоровых асков [Orlowska-Matuszewska and Wawrzycka, 2006]. Также, сверхэкспрессия RNQ1 приводит к подавлению вегетативного роста [Yoshikawa et al. 2011] или летальности [Liu et al. 1996]. Следует отметить, что токсичность сверхэкспрессии RNQI усиливается в присутствии [PIN*] [Douglas et al. 2008], по-видимому, из-за формирования крупных амилоидных агрегатов [по: Stein and True, 2011]. Собственного фенотипического проявления прионизация Rnql не имеет, однако ее можно детектировать по эффективности спонтанного возникновения [PS/] или по агрегации гибридных белков Sup35NM-GFP [Derkatch et al. 2001] или Rnq-GFP [Douglas et al. 2009].
Детерминант [PIN*] является интересной иллюстрацией взаимодействия прионов друг с другом. В присутствии [P/AF] возрастает частота индукции [URE3], а наличие в клетке [PS/] или [URE3] усиливает эффективность спонтанного возникновения de novo [PP1/] [Derkatch et al. 2001]. Интересно отметить, что [PSP] и [LPP3] являются антагонистами по отношению друг к другу [Schwimmer and Masison, 2002]. Следует упомянуть о том, что некоторые варианты [PIN*], напротив, оказывают дестабилизирующее воздействие на слабые варианты [PS/] [по: Derkatch and Liebman, 2007]. Также, в недавно проведенном в лаборатории С. Линдквист исследовании было показано, что [PIN*] значительно повышает частоты индукции прионизации целого ряда последовательностей, слитых с Sup35MC [Alberti et al. 2009]. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что внутри дрожжевой клетки могут существовать сложные «прионные сети», образованные прионами, взаимодействующими между собой [по: Галкин и др. 2006]. Детерминант [PIN*] может быть рассмотрен в качестве фактора, опосредующего возникновение других дрожжевых прионов.