Получение и анализ мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trithorax-like Drosophila melanogaster

• Автор: Федорова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 140 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Нитроны как функциональные элементы генома

1.1.1 Представленность нитронов у различных видов

1.1.2. Теории возникновения нитронов

1.1.3. Консервативность интронов

1.1.4. Роль интронов в геноме

1.1.5. Нитроны - источники некодирующих РНК

1.2. Ген Trithorax-like (TrГ) D.melanogaster

1.2.1. Структура гена Tri

1.2.2. Транскрипция гена Tri
1.2.3. Регуляция экспрессии гена Tri
1.2.4. Доменная структура продукта гена Tri- белка GAGA (GAF)
1.2.5. ДНК-связывающая активность белка GAGA
1.2.6. Белок-белковые взаимодействия белка GAGA
1.2.7. GAF как модификатор структуры хроматина
1.2.7.1. Участие белка GAGA в регуляции экспрессии генов
1.2.7.2. Роль белка GAGA в функционировании различных регуляторных элементов
1.2.8. Взаимодействие белка GAGA с гетерохроматином и его влияние на деление клеток
1.2.9. Белок GAGA требуется для дозовой компенсации у самцов дрозофилы
1.2.10. Характеристика мутаций гена Tri
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы, использованные в работе
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе
2.4. Анализ жизнеспособности
2.5. Приготовление препаратов для световой микроскопии
2.6. Выделение геномной ДНК для использования в ПЦР
2.7. Выделение тотальной РНК из яичников и других тканей дрозофилы

2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.9. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix
2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях
2.11. Получение Р32-меченых ДНК-зондов
2.12. Нозерн-блот гибридизация
2.13. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.14.Лигировани е
2.15. Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli
2.16. Электропорация плазмидной ДНК в клетки E.coli
2.17. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.18. Скрининг бактериальных колоний с помощью ПЦР
2.19. Трансформация генома дрозофилы Р-транспозонами
2.20. Детекция ß-галактозидазы в органах и тканях дрозофилы
2.21. Выделение ядерного экстракта из эмбрионов дрозофил
2.22. Метод торможения ДНК-пробы в геле
2.23. Выделение рекомбинантного белка
2.24. Вектор для трансформации эмбрионов дрозофил
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение мутаций по второму интрону гена Tri
3.2. Идентификация и картирование полученных мутаций
3.2.1. Отбор линий, несущих перестройки
3.2.2. Картирование полученных перестроек
3.3. Анализ жизнеспособности полученных мутантов
j j'y DQÇ
3.3.1. Частичное восстановление жизнеспособности мутантов Trl ' ITrl при введении дополнительных кДНК копий гена Tri
3.4. Анализ экспрессии гена Tri у мутантов Tri1'72
3.5. Выявление консервативных фрагментов во втором нитроне гена Tri
3.6. Изучение связывания ядерных экстрактов и рекомбинантного белка
GAGA с последовательностями второго интрона
3.7. Выявление энхансерных элементов второго интрона гена Tri с помощью
трансформации эмбрионов дрозофилы
Заключение
Выводы
Список литературы

and Treisman, 1994). Возможно, образование гетеродимеров играет роль в регуляции активности GAF in vivo (Espinas et al., 1999).
Недавно было показано, что белок GAGA, благодаря своей способности к олигомеризации посредством BTB/POZ-домена, может облегчать взаимодействие отдалённых регуляторных элементов типа энхансеров со своими промоторами. В экспериментах по трансфекции и реконструкции транскрипции in vitro было показано, что GAF способствует физическому сближению промотора и удалённого от него, часто на многие тысячи оснований, энхансера. Более того, GAF способствует активации промотора не только цис-расположенным энхансером, но даже и в том случае, если энхансер находится в другой молекуле ДНК, т.е. в транс-положении: GAF образует белковый “мост”, физически сближая энхансер с родственным ему промотором (Mahmoudi et al., 2002).
В середине белка GAGA (рис. 4) находится ДИК - с в я з ы в а ю иди й домен - DBD (DNA binding domain) (310-391 а.к.), представляющий собой классический «цинковый палец» (ЦП), относящийся к Cis2-His2 типу, характерного для многих ДНК связывающихся белков (Pedone et al., 1996; Omichinski et al., 1997) и три района, состоящих из основных аминокислот - BR1, BR2 и BR3 (рис. 5). ДНК-связывающий домен содержит два различных мотива, отвечающих за взаимодействия с двуцепочечной ДНК: ЦП (345-365 а.о.) и два района из основных аминокислот (BR1 и BR2). ЦП взаимодействует с большой бороздкой ДНК (на рисунке обозначенной зеленой лентой вокруг последовательности 5’-GAGAG-3’) и его положение стабилизируется дополнительным взаимодействием с BR1 и BR2 (выделенных на рисунке красным цветом). Взаимодействие с последним нуклеотидом А сайта связывания белка GAGA устанавливается благодаря контакту между малой бороздкой ДНК и районом BR1