Влияние мутаций в прионизующем домене белка Sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Бондарев, Станислав Александрович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Оглавление

1. Список сокращений

2. Введение

3. Обзор литературы

3.1. Прионы и амилоиды

3.1.1. Прионы и амилоиды высших эукариот

3.1.2. Прионы и амилоиды низших эукариот

3.1.3. Амилоиды прокариот

3.2. Краткая история исследований фактора [РЛТ]

3.3. [.Р£Г] и терминация трансляции

3.4. «Жизненный цикл» [Р5А]
3.5. Варианты приона [Р£Г]
3.6. Структура белка Бир
3.7. Мутации в гене 81/Р35, влияющие на стабильность фактора [Р£Г]
3.8. Межвидовой барьер для передачи приона [Р57+]
3.9. Модели структурной организации агрегатов 8ир35р
3.10. Заключение
4. Цель и задачи
5. Материалы и методы
5.1. Плазмиды
5.2. Штаммы
5.3. Среды и условия культивирования
5.4. Генетические методы
5.4.1. Высокоэффективная дрожжевая трансформация
5.4.2. Выделение геномной ДНК дрожжей Д. се^1$1ае
5.4.3. Оценка митотической стабильности приона [РДГ]
5.4.4. Оценка передачи и потери приона [ДДГ]
5.4.5. Подсчет количества пропагонов
5.4.6. Оценка эффективности нонсенс-супрессии
И*'',.',-

5.5. Молекулярно-биологические методы
5.5.1. Сайт-направленный мутагенез
5.5.2. Амплификация ДНК для получения и проверки штаммов с делецией гена RNQ
5.5.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
5.5.4. Неспецифическая окраска белков
5.5.5. Полуденатурирующий электрофорез белков в агарозном геле (SDD-AGE)
5.5.6. Вестерн-блот гибридизация
5.5.7. Секвенирование
5.6. Очистка белков из культур Е. coli
5.7. Просвечивающая электронная микроскопия
5.8. Цифровая обработка изображений
5.9. Статистическая обработка
6. Результаты
6.1. Теоретические предпосылки для создания мутантных аллелей SUP
6.2. Характеристика влияния мутаций sup35KK на свойства приоиа [PSP]
6.2.1. Мутации PNM2 и sup35-M2 дестабилизируют | PSI даже в присутствии гена SUP35 дикого типа
6.2.2. При отсутствии аллели SUP35 дикого типа мутации sup35KK оказвают различное влияние на свойства и поддержание приона [P.SY J
6.2.3. Мутации sup35KK не влияют на стабильность белка Sup35p
6.2.4. Передача и потеря приона в присутствии мутаций sup35KK
6.2.5. Мутации sup35-Ml и sup35-M2 приводят к исчезновению агрегатов Sup35p
6.2.6. Белки Sup35-Ml и Sup35-M2 включаются в состав прионных агрегатов [РДГ]
6.2.7. Мутации sup35-Ml и sup35-M2 могут индуцировать возникновение

приона [PSP] de novo
6.2.8. Дестабилизация [ PSP] в присутствии sup35-M2 зависит от количества клеточных делений
6.2.9. Мутации sup35~M3, sup35-M4 и sup35-M5 не влияют на митотическую стабильность приона [Д£Г]
6.2.10. Мутации sup35-M4 и sup35-M5 приводят к изменению размера агрегатов Sup35p
6.2.11. Вес мутантные аллели незначительно увеличивают стабильность агрегатов Sup35p при нагревании
6.2.12. Мутация sup35-M4 приводит к формированию нового, болсс «сильного» варианта приона [РДГ]
6.2.13. Мутация sup35-M5 приводит к уменьшению числа иропагонов
в клетке
6.3. Влияние комбинаций му таций sup35KK на стабильность приона [/YS7+]
6.3.1. Мутации sup35-M2 и sup35-M4 дестабилизируют прион [PSP] при сочетании с другими аллелями sup35KK
6.3.2. Дестабилизация [PSP ] в присутствии сочетаний мутаций sup35KK сопровождается увеличением размера агрегатов Sup35p
6.3.3. Сочетания мутаций sup35KK модифицируют термостабилыюсть агрегатов Sup35p
6.4. Зависимость эффектов мутаций sup35KK от варианта приона [Д£Г]
6.5. Эффекты мутаций sup35KK не зависят от [В/ДЦ-статуса клеток
6.6. Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro
7. Обсуждение
7.1. Влияние мутаций sup35-Ml и sup35-M2 на стабильность [PSP]
7.2. Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sap35-M5 на свойства
приона [РД/+]
7.3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона |/7S7' |..
7.4. Заключение

аминокислот на заряженные, а также то, что все они локализуются в пределах региона Sup35p, необходимого для поддержания [PSP] (с 1 по 64 а.к.) (Тег-Avanesyan et al., 1994; Osherovich ct al., 2004). Это подтверждает высокую значимость этого участка для сохранения приона. Тем не менее, в С-домене Sup35p также были обнаружены миссенс-мутации (Т314А или T314D), которые приводят к потере фактора [AST], Эти замены замедляют процесс формирования агрегатов Sup35p in vitro, а также не могут поддерживать прион in vivo. Учитывая эти данные, нельзя исключить, что С-домен Sup35p также оказывает влияние на стабильность приона [AST] (Kabani et al., 2011).
Таблица 2. Влияние мутантных аллелей на фенотип штаммов, несущих фактор [Р5/+]
(модифицировано из (Zhouravleva et al., 2002)) *' - (Doel et al., 1994); ”2 - (King, 2001); ‘3 - (DePacc etal., 1998).
Замена Фенотипические эффекты мутантного белка
Sup35-PNM2 (G58D)*’ Потеря [PST]
G7D*2 Антисупрессия
N12K*2 Антисупрессия
Q15R*2 Антисупрессия
S17R*2 Антисупрессия
G20D*2 Антисупрессия
G25D*2 Антисупрессия
G44R*2 Потеря psn
G54E*2 Антисупрессия
G58N*2 Антисупрессия
G58S*2 Антисупрессия
N8D*3 Антисупрессия
N8S*3 Антисупрессия
N9K, Q24R, двойная замена*3 Потеря Г/’*?/’!
Ql OR, Q91L, двойная замена*3 Потеря РБГ~
N12D*3 Антисупрессия
QJ4R*3 Антисупрессия
Q15R*3 Антисупрессия
В завершение этого раздела необходимо еще раз подчеркнуть, что эффекты рассмотренных мутаций специфичны по отношению к конкретному варианту приона (Derkatch et al., 1999; King, 2001; Lin et al., 2011) и в некоторых случаях зависят от структурной организации прионных агрегатов Sup35p (Verges et al., 2011).