Дифференциальная композиция эпигенетических маркеров сегментов метафазных хромосом человека

• Автор: Ефимова, Ольга Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 152 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярно-цитогенетическая организация генома человека

1.1.1. Блочная организация хромосом человека

1.1.2. Повторяющиеся последовательности в геноме человека

1.1.3. Изохорная организация генома человека

1.1.4 Гетерохроматин

1.1.5. Эухроматин

1.2. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов у человека

1.2.1. Метилирование ДНК
1.2.1.1. Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК
1.2.1.2. Механизмы деметилирования ДНК
1.2.1.3. Сайты метилирования ДНК и их локализация в геноме человека
1.2.1.4. Регуляция генетической экспрессии с помощью
метилирования ДНК
1.2.1.5. Метилирование ДНК и геномный импринтинг
1.2.2. Модификации гистонов
1.2.2.1. Ацетилирование
1.2.2.2. Фосфорилирование
1.2.2.3. Метилирование
1.2.2.4. Механизмы регуляции транскрипции посредством
модифицирования гистонов
1.2.3. Варианты гистоновых белков
1.2.3.1. Варианты гистона Н2А
1.2.3.2. Варианты гистона НЗ
1.2.4. Взаимосвязь эпигенетических механизмов регуляции структурно-функционального состояния генома
1.2.5. Эпигенетическое репрограммирование генома
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1. Материал исследования

2.2. Методы исследования
2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом для
иммуподетекции 5-метилцитозина
2.2.1.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови
2.2.1.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом из ворсин хориона и из фрагментов эмбриональных тканей
2.2.1.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом из бластомеров доимтаптационпых зародышей
2.2.1.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом из мезенхгшных стволовых клеток человека
2.2.2. (ЗИН окрашивание препаратов метафазных хромосом
2.2.3. Денатурация и иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов метафазных хромосом с помощью моноклональных антител к 5-метилцитозину
2.2.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом для иммуподетекции ацетилированного по лизину в 9-м положении гистоиа НЗ
2.2.4.1. Культивирование лимфоцитов периферической крови взрослых индивидов человека и пуповинной крови плодов человека для иммуподетекции ацетилированного гистона НЗ
2.2.4.2. Фиксация метафазных хромосом раствором
параформальдегида
2.2.4.3 Фиксация метафазных хромосом спиртовым раствором 2% ледяной уксусной кислоты
2.2.5 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов метафазных хромосом с помощью моноклональных антител к ацетилированному по лизину в 9-м положении гистону НЗ
2.2.6 ЮЗА окрашивание препаратов метафазных хромосом
2.2.7Анализ препаратов
2.2.8 Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала и
статистическая обработка результатов

2.2.8.1. Посегліентіюе сравнение интенсивности флуоресцентного сигнала
2.2.8.2. Построение графиков распределения флуоресцентного сигнала разной интенсивности вдоль плеч хромосом
2.2.8.3. Сравнение интенсивности флуоресценции метафазных пластинок
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Поперечная исчерченность метафазных хромосом из лимфоцитов взрослых индивидов человека, выявляемая методом пммуподетекцнн 5-метнлцитозина
3.2. Дифференциальное метилирование ДНК метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови взрослых индивидов и пуповинной крови плодов человека
3.3. Сравнительный анализ характера метилирования ДНК гомологичных хромосом X в лимфоцитах взрослых и плодов человека. Влияние 5-бром-2-дезокснуриднна на нммуноцнтохнмнческую детекцию 5-мстилцнтозина
3.4. Специфичность локализации ацстилированного гистоиа НЗ на метафазных хромосомах из лимфоцитов взрослых и плодов человека
3.5. Сопоставление метилирования ДНК и ацстнлнрованпя гистоиа НЗ на метафазных хромосомах в лимфоцитах взрослых индивидов и плодов человека
3.6. Распределение 5-метилцитознна на метафазных хромосомах из различных типов клеток эмбрионов человека
3.7. Динамические изменения метилирования ДНК метафазных хромосом из клеток цнтотрофобласта хориона человека в 1-м и 2-м триместре развития
3.8. Метилирование ДНК дополнительных и структурно перестроенных хромосом в клетках цнтотрофобласта хориона при неразвивающейся беременности
3.9. Стадноспецнфичные последовательные изменения метилирования ДНК родительских геномов в бластомерах дробящихся зародышей человека

Второй путь активного деметилирования обеспечивается семейством белков AID/APOBEC. В результате их дезаминирующей активности из 5-метилцтозина образуется тимин, который затем заменяется на цитозин с помощью гликозилаз TDG и SMUG. Третий способ активного деметилирования реализуется при участии всех трех белковых семейств. 5-гидроксиметилцитозин, образовавшийся в результате активности белков ТЕТ, подвергается воздействию дезаминаз AID/APOBEC. Это приводит к образованию 5-гидроксиметилурацила, который в процессе эксцизионной репарации заменяется цитозином (Bhutani et al., 2011).
Таким образом, механизмы и ферменты активного деметилирования, долгое время являющиеся предметом поисков, на сегодняшний день идентифицированы. Открытие механизма активного деметилирования ДНК ставит ряд вопросов, касающихся особенностей этого процесса на разных этапах онтогенеза в норме и при патологии. Активное деметилирование является значимым этапом эпигенетического репрограммирования в эмбриогенезе млекопитающих. Однако аберрантная инициация активного деметилирования в дифференцированных клетках может быть связана с их злокачественной трансформацией. Каким образом регулируется процесс активного деметилирования и как в организме достигается баланс, при котором гидроксилирование 5-метилцитозина остается только частью регуляторного процесса, но не приводит к негативным последствиям, остается неясным.
1.2.1.3. Сайты метилирования ДНК и их локализация в геноме человека
Метилирование ДНК происходит, преимущественно в динуклеотидах 5’-CpG-3’. С невысокой частотой метилированные молекулы цитозина встречаются в последовательностях 5'-CpNpGp-3' или асимметричных последовательностях 5'-СрА-3' и 5'-СрТ-3' (Кирнос и др., 1981). В эмбриональных стволовых клетках уровень 5-метилцитозина, не входящего в состав динуклеотида 5’-CpG-3’, достигает 20%; в процессе дифференцировки клеток его содержание значительно снижается (Ramsahoye et al., 2000; Lister et al. 2009). В геномах млекопитающих, в том числе у человека, 5-метилцитозин составляет около 1% всех нуклеотидов в ДНК. Метилированное состояние характерно примерно для 70% CpG динуклеотидов. Уровень метилирования неодинаков для разных тканей, стадий развития и участков ДНК. Метилированные участки ДНК характерны для хроматина, в состав которого входит поздно реплицирующаяся ДНК, труднодоступная для транскрипционных ф>акторов (Bird, 1995; Пендина и др., 2004; Ефшмова и др., 2012а).