Плейотропные эффекты нарушения терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Петрова, Александра Владиленовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 172 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
L ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Факторы терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и последствия
нарушения их функции
1.1. Терминация трансляции
1.1.1. Терминация трансляции у прокариот
1.1.2. Терминация трансляции у эукариот
1.2. Факторы терминации трансляции дрожжей Saccharomyces cerevisiae
1.2.1. Фактор терминации дрожжей I класса
1.2.2. Фактор терминации дрожжей II класса
1.2.3. Взаимодействие факторов eRFl и eRF3 между собой
1.2.4. Плейотропные эффекты и взаимодействие факторов eRF
и eRE3 с другими белками
1.2.4.1. Супрессия мутаций сдвига рамки считывания
1.2.4.2. Взаимодействие с доминантными супрессорами
1.2.4.3. Взаимодействие с антисупрессорами
1.2.4.4.Температуро- и осмочувствительность
1.2.4.5. Влияние мутаций в генах SUP45 и SUP35 на митохондриальные функции
1.2.4.6. Влияние мутаций в генах SUP45 и SUP35
на клеточный цикл
1.2.4.7. Взаимодействие факторов терминации
трансляции с цитоскелетом
1.2.4.8.Взаимодействие факторов терминации трансляции с другими белками
1.3. Псевдогифальный рост
1.3.1. Филаментозный рост у различных видов грибов

1.3.2. Псевдогифальный рост у дрожжей У cerevisiae
1.3.2.1. Роль источника азота в индукции псевдогифального роста у дрожжей
1.3.2.2. Основные пути регуляции псевдогифального и инвазивного роста
1.3.2.3. Факторы, приводящие к нарушению псевдогифального роста
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы
2.2. Плазмиды
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Генетические методы
2.4.1. Индукция псевдогифального и инвазивного роста
2.4.2. Количественный тест на индукцию незаконной гибридизации
2.5. Молекулярно-генетические и биохимические методы
2.5.1. ГГТТР в реальном времени
2.5.2. СНЕЕ-электрофорез
2.5.3. Окрашивание культур клеток калькофлуором белым
2.5.4. Анализ характера почкования
2.5.5. Транскриптомный анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Диплоидные штаммы, несущие мутантные аллели
гена 811Р45, не способны к псевдогифальному росту в условиях голодания по азоту
3.2. Штамм Д1631 содержит аллель генаЕХШ дикого типа
3.3. Замещение аллели БиР45 дикого типа на мутантные аллели
$ир45 в диплоидном штамме
3.3.1. Замещение плазмиды с геном БиР45 дикого типа на плазмиды, несущие супрессорные мутантные аллели зир45 в штамме-дизруптанте, приводит к изменению

типа спаривания штамма
3.3.2. Замещение плазмиды с геном 811Р45 дикого типа в штамме, несущем супрессорные мутантные аллели $ир45 на хромосоме
3.3.3. Замещение аллели гена 8Р!Р45 дикого типа на мутантные
аллели &ир45, не приводящие к повышению уровня нонсенс-супрессии, приводит к изменению типа спаривания в штамме Д1631
3.4. Диплоидные штаммы, содержащие мутантные аллели
зир45 в гетерозиготном состоянии, сохраняют тип
спаривания МАТа/МАТа
3.5. Изучение причин изменения типа спаривания у диплоидных штаммов при замещении аллели 811Р45 дикого на мутантные аллели хир45
3.5.1. Необратимое изменение типа спаривания у штаммов,
гемизиготных по мутациям зир45
3.5.2. Неслучайность потери одного из гомологов III хромосомы
у мутантов зир45
3.5.3. Анализ МАТ-статуса диплоидных штаммов с помощью ПЦР
3.5.4. Штаммы, гемизиготные по мутантным аллелям гена
81/Р45, характеризуются потерями хромосом 1-Ш
3.5.5. Оценка наличия хромосомных перестроек в штамме
Д1631, несущем мутантные аллели $ир45, с помощью пульс-электро фореза
3.5.6. Оценка характера и частоты событий, приводящих к изменению типа спаривания диплоидов, гемизиготных по мутантным аллелям гена 81РР45
3.6. Анализ влияния повышенного уровня сАМР на способность штаммов, несущих мутантные аллели $ир45, к
псевдогифальному росту
3.7. Анализ экспрессии генов на фоне мутантной аллели зир45-103 в условиях недостатка азота
3.7.1. Гены, экспрессия которых изменилась на фоне обеих аллелей

Мишень cAMP - протеинкиназа А (РКА.) состоит из регуляторной субъединицы, кодируемой геном BCY1, и трех каталитических субъединиц, кодируемых генами ТРК1, ТРК2 и ТРКЗ (Cannon and Tatchell, 1987; Toda et al., 1987a; Toda et al., 1987b). При отсутствии индуцирующего сигнала. РКА существует в виде неактивного тетрамера, состоящего из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. сАМР, уровень которого повышается под действием внешнего сигнала, связывается с регуляторными субъединицами, что вызывает в них конформационные изменения и приводит к снижению их сродства с каталитическими субъединицами. Результатом этого является диссоциация тетрамера и переход каталических субъединиц в активное состояние. Восстановление неактивного состояния РКА обеспечивается за счет фосфодиэстераз Pdel и Pde2, осуществляющих гидролиз сАМР (Sass et al., 1986; Nikawa et al., 1987). Первоначально предполагалось, что функции субъединиц Tpkl, Tpk2 и ТркЗ избыточны, поскольку нарушение жизнеспособности на фоне делеции всех трех генов может быть компенсировано экспрессией любого из них. Тем не менее, роль разных субъединиц в регуляции филаментозного роста оказалась различной. Так, делеция гена ТРК2 ингибирует псевдогифальный рост, а делеция гена ТРКЗ, напротив, стимулирует (Robertson and Fink, 1998). Для субъединицы Tpkl также был показан негативный эффект на псевдогифальный рост, аналогичный ТркЗ. Вместе с тем, было показано, что Tpkl может частично замещать функции Трк2 при дизрупции кодирующего ее гена (Robertson and Fink, 1998; Pan and Heitman, 1999).
Протеинкиназа А фосфорилирует большой спектр мишеней, регулируя процессы, обеспечивающие рост клетки, ответ на изменение условий среды и стресс, в том числе «сенсинг» и утилизацию питательных веществ, энергетический обмен, клеточный цикл, споруляцию и старение, а также характер почкования и псевдогифальный рост (Estruch, 2000; Santagelo, 2006). В сигнальном каскаде, регулирующем филаментозный рост, ее мишенями являются два транскрипционных фактора, антагонистически регулирующих экспресиию гена FLOll в ответ на изменение уровня сАМР. Ген FL08