Роль сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis

• Автор: Лобанов, Константин Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пуриновый метаболизм у Bacillus subtilis и его регуляция

1.1.1. Синтез пуриновых нуклеотидов de novo

1.1.2. Ферменты, участвующие в процессе биосинтеза IMP de novo

1.1.3. Генетический контроль биосинтеза пуринов у В. subtilis

1.1.4. Регуляция экспрессии генов пуринового метаболизма у В. subtilis

1.2. Регуляция экспрессии генов с участием сенсорных РНК

1.2.1. Структурная организация сенсорных РНК

1.2.2. Механизмы регуляции экспрессии генов с участием сенсорных РНК

1.2.3. Классификагщя сенсорных РНК
1.2.4. Пуриновые сенсорные РНК
1.2.4.1. Структура аптамерного домена пуриновых сенсорных РНК
1.2.4.2. Гуаниновая и адениновая сенсорная РНК: похожие
аптамеры, но различные лиганды
1.2.4.3. Разновидности 2 ’-дезоксигуанозин-специфичных сенсорных

1.2.4.4. PreQi (7-аминометш-7-дезазагуанин) сенсорные РНК
1.2.4.5. Комплексные функции и применение пуриновых сенсорных РНК
1.2.4.5.1. Тандемное действие гуанинового аптамера и
элемента ykkC
1.2.4.5.2. Кинетические и термодинамические аспекты функционирования сенсорных РНК
1.2.4.5.3. Гуаниновые сенсорные РНК как потет/иальиые антибактериальные мишени
1.3. AICAR как регулятор клеточного метаболизма
1.3.1. Метаболическая регуляция с участием AICAR в клетках животных
1.3.2. Роль AICAR в метаболизме бактерий
1.3.3. Участие AICAR в регуляции метаболизма дрожжей
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования
2.3. Выделение ДНК В. subtilis
2.4. Манипуляции с плазмидиой ДНК

2.5. Препараты ферментов
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.7. Выделение и очистка продуктов ПЦР
' 2.8. Сайт-направленный мутагенез
f 2.9. Получение мутаций в лидерной области риг-оперона
2.10. Конструирование транскрипционных фъюзов purE-lacZ
2.11. Конструирование транскрипционных фыозов purH-lacZ
2.12. Получение делеции терминатора транскрипции в лидерной области
; рнг-оперона
, 2.13. Транскрипция in vitro
2.14. Определение активности /3-галактозидазы
2.15. Условия ферментации
2.16. Определение концентрации AICAR в культуральной жидкости
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение регуляторных элементов, контролирующих экспрессию
пуринового оперона Bacillus subtilis
3.1.1. Клонирование лидерной области риг-оперона
и ее компьютерный анализ
; 3.1.2. Сайт-направленный мутагенез лидерной области риг-оперона
- 3.1.3. Изучение экспрессии транскрипционных фъюзов purE-lacZe
? клетках В. subtilis
3.1.4. Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК
( риг-оперона
' 3.1.5. Синергидный эффект мутации в регуляторном локусе purR
и делеции терминатора транскрипции в лидерной области на экспрессию риг-оперона
| 3.1.6. Изучение влияния внутреннего Rho-независимого терминатора
* транскрипции на экспрессию дистальных генов риг-оперона
3 3.2. Особенности структурно-функциональной организации лидерной
области гена pbuE Bacillus subtilis и его регуляции
; 3.2.1. Определение старта транскрипции гена pbuE
! 3.2.2. Влияние пуриновых производных на экспрессию гена pbuE

; 3.2.3. Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE
3.2.4. Характеристика мутантов, содержащих замены в лидерной
области гена pbuE
3.3. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR (акадезина) - перспективного
* кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического
, применения

3.3.1. Усиление экспрессии риг-оперона В. subtilis
3.3.2. Получение делеции гена ригН в составе хромосомы В. subtilis
3.3.3. Конструирование интегративного экспрессиоиного вектора на
основе плазмиды pDG
3.3.4. Сайт-направленный мутагенез гена prs E. coli (ргвЦ
3.3.5. Сайт-направленный мутагенез гена purF E. coli (purFe)
3.3.6. Определение продуктивности штаммов в отношении накопления
AICAR
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ*
ADP аденозиндифосфат
АТР аденозинтрифосфат
Pi неорганический фосфат
кДа тысяча Дальтон
ВКПМ Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов
LB среда Лурия - Бертани
X-gal 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-В-галактопиранозид
п.о. пар оснований
* - приведены только те сокращения, которые не имеют расшифровки в тексте диссертации. В работе использованы стандартные однобуквенные и трехбуквенные обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Р1 и РЗ (рис. 9В) [89, 90]. Второй принцип заключается в том, что простые спирали и псевдо-петли, как правило, располагаются в параллельной конфигурации (рис. 9В). Такое «архитектурное построение» обнаруживается почти у всех типов РНК, содержащих три и более спиральных элемента [111]. Примечательным исключением из этого правила является тРНК, у которой два спиральных элемента располагаются перпендикулярно, посредством взаимодействия Б- и Т-петель.
РНК-спирали в далнейшем образуются благодаря последовательности мотивов; которые принимают различные вторичные структуры: концевые петли, внутренние выпуклости и петли, и мультиспиральные узлы [87, 110]. Одним из самых распространенных РНК-мотивов является концевая четыренуклеотидная. петля ОААА [112]. Эта петля представляет собой последовательность аденозинов, которая узнается другим РНК-мотивом, выступающим в роли рецептора [113-115]. Этот мотив, в свою очередь, недавно был охарактеризован как подкласс сенсорных РНК, специфичных к циклическому сй-ОМР [116]. Взаимодействие между петлей и рецептором обеспечивает стабилизацию двух спиралей, расположенных вместе бок о бок, что в итоге облегчает параллельность укладки в пространственной структуре. Другие, общие для всех типов РНК, структурные элементы, например, «изгиб-поворот» (ктпк-Шш, К-Шгп) [117, 118], взаимодействие по типу «целующаяся петля» (каязищ^оор) [101], последовательность 5’-АСиАССАС1АОСА-3’, называемой сарцин-рициновой петлей [119, 120], Т-петли (Т-кюре) [69] и псевдоузлы [121] были также обнаружены и у сенсорных РНК. Мультиспиральные узлы также являются важнейшими компонентами сенсорных РНК, однако их последовательности и структуры разнообразны, что обусловлено уникальностью характера расположения фланкирующих спиралей [122].
Важность рассмотренных архитектурных элементов для общего функционирования сенсорной РНК подчеркивается в исследованиях, при которых, вносимые в эти последовательности изменения, приводили к тому, что сенсорная РНК переставала функционировать в физиологических