Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus : arvicolidae, rodentia

• Автор: Григорьева, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стволовые клетки и их типы

1.1.1. Эмбриональные карциномные клетки. Тератомы, тератокарциномы

1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки

1.1.2.1. Механизмы сохранения плюрипотентности и гены, участвующие в поддержании шнорипотентного статуса линий ЭС клеток

1.1.2.2. Маркеры, характерные для плюрипотентных клеток

1.1.3. Эмбриональные герминальные клетки

1.1.4. Трофобластные стволовые клетки

1.1.4.1. Постпмплантационное развитие эмбрионов, дифференцировка трофобластных клеток in vivo и формирование плаценты
1.1.4.2. Получение и дифференцировка ТС клеток
1.1.4.3. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, характерные для ТС клеток мыши и их производных
1.1.5. Стволовые клетки экстраэмбриональной энтодермы
1.2. Инактивация Х-хромосомы в клетках самок .млекопитающих
Итоги обзора литературы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Экспериментальные животные
2.2. Растворы, буферы
2.3. Среды для получения и культивирования клеточных линий
2.3.1. Ростовая среда для получения и культивирования первичных эмбриональных фибробластов
2.3.2. Ростовая среда для культивирования ЭС клеток мыши
2.3.3. Ростовая среда для получения и культивирования СК полевки эмбрионального происхождения
2.3.4. Приготовление кондиционной среды для культивирования СК полевки без эмбриональных фибробластов
2.3.5. Ростовая среда для культивирования ТС клеток мыши

2.3.6. Среда для культивирования эмбриоидных тел
2.4. Получение культур клеток
2.4.1. Получение первичных эмбриональных фибробластов
2.4.2. Получение стволовых клеток полевки из предымплантационных бластоцнст
2.4.3. Получение ЭГ клеток полевки из эмбрионов на стадии 7,5-8,5 д.н.о
2.5. Культивирование клеток
2.5.1. Культивирование первичных эмбриональных фибробластов
2.5.2. Культивирование и селекция СК полевки
2.5.3. Культивирование ЭС клеток мыши
2.5.4. Культивирование ТС клеток мыши
2.6. Замораживание клеток в жидком азоте
2.7. Размораживание клеток
2.8. Субклонированис
2.9 Тесты но оценке плюрипотентности линий полученных клеток
2.9.1. Гистохимическое выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы
2.9.2. Спонтанная дифференцировка in vitro стволовых клеток полевок
2.9.3. Дифференцировка СК полевок in vivo
2.9.4. Иммуногистохимичсское выявление поверхностных клеточных антигенов ЕСМА7 и SSEA-1, транскрипционных факторов GATA4 и GATA6
2.10. Анализ кариотипа стволовых клеток
2.10.1. Фиксация клеток в суспензии
2.10.2. Фиксация культуры клеток в чашке Петри
2.10.3. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-окрашивание)
2.10.4. Анализ плоидности линий СК полевок при помощи ДНК профилирования ядер клеток
2.11. Выделение РНК
2.11.1. Общие требования
2.11.2. Выделение РНК с помощью RNAzol В
2.11.3. Обработка РНК ДНКазой1
2.12. Синтез к ДНК методом обратной транскрипции
2.13. Полимеразная цепная реакция
2.14. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.15. Флуоресцентная in situ гибридизация
2.16. РНК-ДНК флуоресцентная in situ гибридизация

транскрипционного фактора гомеодомена Caudal-related homeobox 2 (Cdx-2).
Ген Cdx-2 наиболее активно транскрибируется во внешних полярных бластомерах морулы и в ТЭ, но отсутствует в клетках ВКМ (Kunath et al., 2004; Rossant, 2007). Существует предположение, что прекращение экспрессии гена Cdx-2 во внутренних клетках ранней морулы может являться первым событием в процессе разделения двух типов клеток: ВКМ и ТЭ. Было показано, что избыточная экспрессия гена Cdx-2 в ЭС клетках приводит к подавлению транскрипции гена Oct3/4 и дифференцировке их в ТЭ, хотя и без образования гигантских клеток (Niwa et al., 2005). При культивирований таких клеток в присутствии FGF4, гепарина и ЭФМ-КС происходило образование ТС-подобных эпителиальных колоний, а при инъекции в бластоцисты мыши, подобно ТС клеткам, они делали вклад исключительно в плаценту (Niwa et al., 2005).
В экспериментах на эмбрионах с гомозиготной делецией по гену Cdx-2 обнаружили, что мутация гена приводит к их гибели до стадии имплантации. Происходит формирование нормальных ранних бластоцист, но затем возникает нарушение детерминации ТЭ, бластоцель “схлапывается”, эмбрионы не способны вылупиться из прозрачной оболочки и, следовательно, не в состоянии имплантироваться в матку (Slrumpf et al., 2005). В Cdx-2'А эмбрионах отсутствует экспрессия генов Handl и Р1-1, маркеров гигантских клеток, что подтверждает нарушение дифференцировки ТЭ. Также было показано, что ген Cdx-2 вызывает подавление экспрессии генов Oct4 и Nanog во внешних клетках бластоцисты (Strumpf et al., 2005). Таким образом, ген Cdx-2 является самым ранним из известных генов, который приводит к разделению линий ВКМ и ТЭ, его экспрессия необходима для всех аспектов раннего развития ТЭ, как пролиферации диплоидных клеток, так и для развития полиплоидных гигантских клеток.
Транскрипционный фактор Т-бокса, ген Eom.es является другим геном -мишенью для FGF сигнала, важным для развития эмбриона и пролиферации ТЭ. Он экспрессируется в ТЭ бластоцист и в ЭкЭ ранних постимплантационных бластоцист (Ciruna, 1999; Russ, 2000) и подобно гену Cdx-2 может влиять на образование ТЭ. Исследователями на ЭС клетках было показано, что ген Homes может быть мишенью для гена Cdx-2 (Niwa et al., 2005). При гомозиготной мутации эмбрионов по гену Eomes формируются бластоцисты, в ВКМ которых экспрессируется ген Oct4, а в