Распознавание сайтов связывания транскрипционных факторов SF-1 и Srebp на ДНК с помощью экспериментально-компьютерного подхода

• Автор: Климова, Наталья Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 155 с. : ил.

Список используемых сокращений
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Компьютерные методы поиска сайтов связывания транскрипционных факторов в эукариотических генах
и их экспериментальная проверка
1.1. Распознавание сайтов связывания транскрипционных
факторов методами, использующими обучающие выборки
1.1.1. Источники обучающих выборок сайтов связывания транскрипционных факторов
1.1.2. Компьютерные методы распознавания сайтов связывания транскрипционных факторов, основанные на обучении
1.1.2.1. Методы консенсуса и весовых матриц 1 б
1.1.2.2. Подходы, основанные на выявлении конформационных
и физико-химических параметров ДНК. Метод SITECON
1.1.2.3. Подходы, основанные на методах дискриминатного анализа. Метод SiteGA
1.1.3. Оценка точности методов распознавания
1.2. Распознавание сайтов связывания транскрипционных
факторов de novo
1.2.1. Методы поиска сверхпред ставленных мотивов
1.2.2. Филогенетический футпринтинг
2. Экспериментальные методы проверки сайтов связывания транскрипционных факторов, предсказанных с помощью компьютерных методов
3. Транскрипционный фактор SF-1
3.1. Строение SF-1
3.2. Экспрессия SF-1 и его гены-мишени
4. Транскрипционные факторы SREBP
4.1. Строение SREBPs
4.2. Процессинг SREBP
4.3. Сайты связывания SREBP белков
4.4. Изоформы SREBP
4.5. Гены - мишени SREBP
5. Заключение по обзору литературы
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы, использованные в работе
2. Олигонуклеотиды
3. Животные
4. Выделение экстрактов ядер из клеток семенников и печени
5. Получение рекомбинантного белка SREBP-la(His)6 человека

5.1. Получение плазмидной конструкции, экспрессирующей
SREBP-1а человека
5.2. Экспресс-очистка образцов ДНК с помощью
гель-фильтрации
5.3. Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli
5.4. Трансформация клеток E.coli
5.5. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
5.6. Секвенирование
5.7. Наработка рекомбинантного белка SREBP-la(His)6 и его
очистка с помощью хромотографии на Ni-сефарозе
5.8. Электрофорез белков по методу Лэммли
6. Задержка ДНК-зонда в геле
6.1. Введение радиоактивной метки в ДНК с помощью фрагмента
Клёнова
6.2. Торможение ДНК-зонда в геле белками экстракта ядер клеток
семенников или печени
6.3. Торможение ДНК-зонда в геле SREBP-la(TIis)6 белком
7. Гибридизация со специфическими антителами
7.1. Получение осветлённых клеточных лизатов
7.2. Вестерн-блот анализ
8. Иммунопреципитация хроматина
8.1. Иммунопреципитация хроматина
8.2. Выявление фрагментов ДНК, содержащих сайты
связывания SF-1, с помощью ПЦР
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Экспериментальная проверка сайтов связывания SF-1, распознанных методами SiteGA, SITECON и SiteGA в сочетании с оптимизированной динуклеотидной весовой матрицей
2. Исследование способности SRE, распознанных методом SITECON, связываться с белками экстракта ядер клеток печени и рекомбинантным SREBP-la
3. Поиск потенциальных генов-мишеней SF-1 белка в геноме человека на основе распознавания потенциальных SF-1 сайтов методом SiteGA
3.1. Анализ распределения сайтов связывания SF-1 в промоторных
районах генов системы стероидогенеза и критерий поиска потенциальных генов-мишеней SF-1 в геномных последовательностях
3.2. Выявление генов-мишеней SF-1 в геноме человека
3.3. Экспериментальная проверка выдвинутого на основе компьютерного анализа генома человека предположения об экспрессии SF-1 в ряде органов мужской репродуктивной системы
4. Обсуждение
ВЫВОДЫ
Список цитируемой литературы

Список используемых сокращений
ТФ - транскрипционный фактор;
ССТФ - сайт связывания транскрипционного фактора;
ГР - рецептор глюкокортикоидов;
PWM - весовая матрица;
SiteGA+PWM - метод SiteGA в сочетании с оптимизированной
динуклеотидной весовой матрицей (PWM);
лпд - локально-позиционированные динуклеотиды;
а.о. - аминокислотный остаток;
кДа - килодальтон;
п.н. - пар нуклеотидов;
АКТГ - адренокортикотропный гормон;
ЭПР - эндоплазматический ретикулум;
ДНКаза I — дезоксирибонуклеаза I;
ПААГ - полиакриламидный гель;
EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assays, метод задержки ДНК-зонда в
геле;
ПЦР - полимеразная цепная реакция.

мРНК
SREBP
SREBP-1a
SREBP-1 с

2 MDDSGELGG LETMETLTELGDELTLGDIDEMLQFVSNQVGEFPDLFSEQL lc MDCTF EDMLQLINNQDSDFPGLFDPP
1 a M DEPPFSEAALEQALGEPCDLDAALLTDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDPP
SREBP-1 a

374 / 427

1147

Район, содержащий «-» заряженные аминокислотные остатки («кислый») bHLH (основный район типа «спираль-петля-спираль»)
ZIP (район типа лейциновая «застёжка»)
Серин/пролин богатые районы
Рисунок 5. Изоформы SREBP.
А - схематическое изображение изоформ SREBP-1 (SREBP-la и SREBP-lc). Med/DRIP - медиаторный комплекс (Med - mediator complex; DRIP - vitamin D receptor-interacting protein); СВР — белок, связывающий CREB.
Б - сравнение N-концевых аминокислотных остатков SREBP-2, -1с и -1а человека. Жирным шрифтом выделена последовательность соответствующая а-спирали [Cardinaux et al., 2000].
В - доменное строение SREBP-la. Цифрами обозначены позиции аминокислотных остатков в белке.