Генетические свойства и структура плазмид природных штаммов Bacillus subtilis

• Автор: Полуэктова, Елена Ульриховна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 220 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Конъюгация у бактерий
2.1.1. Основные закономерности конъюгации (на примере Р-фактора Е. соИ)
2.1.1.1. Общая характеристика конъюгации
2.1.1.2. Этапы конъюгации
2.1.1.3. Гены и белки конъюгации
2.1.1.4. Регуляция процесса конъюгации
2.1.2. Сходство элементов конъюгативного аппарата с компонентами
системы секреции IV типа
2.1.3. Конъюгативная мобилизация
2.1.4. Конъюгативные транспозоны
2.1.5. Особенности конъюгации у грам-положительных микроорганизмов
2.1.6. Особенности конъюгации у бацилл
2.1.6.1. Конъюгация у бацилл группы В. сегеих
2.1.6.2. Конъюгация у бацилл группы В.яиЫШх
2.2. Плазмиды бацилл
2.2.1. Мелкие плазмиды бацилл
2.2.1.1. гер-модуль ЯСЯ-плазмид и общая схема ЯС-репликации
2.2.1.1.1. с15о
2.2.1.1.2. Яер-белки
2.2.1.1.3. ио
2.2.1.1.4. Регуляция ЯС-репликации
2.2.1.2. Локусы, обуславливающие стабильное наследование плазмид
2.2.1.3. Модули устойчивости к антибиотикам
2.2.1.4. тоЬ-модуль
2.2.1.5. яр-модуль
2.2.1.6. гар-модуль
2.2.1.7. Прочие элементы генома ЯСЯ-плазмид
2.2.1.8. Способность ЯСЯ-плазмид к интеграции в другие репдиконы
2.2.1.9. Стабильность ЯСЯ-плазмид и их использование в качестве векторов
2.2.2. Крупные плазмиды бацилл
2.2.2.1. Репликативный модуль крупных плазмид
2.2.2.1.1. Репликативный модуль плазмид группы А
2.2.2.1.2. Репликативный модуль плазмид группы Б
2.2.2.1.3. Репликативный модуль плазмид группы Е
2.2.2.1.4. Репликативный модуль плазмид группы?
2.2.2.1.5. Репликативные модули плазмид с неопределенной классификацией
2.2.2.2. Сегрегационные модули
2.2.2.3. Модули токсинообразования на тета-плазмидах бацилл
2.2.2.4. Мобильные элементы крупных плазмид бацилл
2.2.2.5. Прочие генетические модули крупных плазмид бацилл
2.2.2.6. Векторы на основе крупных плазмид бацилл
2.2.2.7. Характеристика отдельных крупных плазмид бацилл
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Штаммы микроорганизмов и плазмиды
3.2. Реактивы
3.3. Среды
3.4. Выделение ДНК
3.5. Трансформация бактериальных клеток и протопластов
3.6. Конъюгативные скрещивания
3.7. Рестрикция и лигирование ДНК
3.8. Отбор клонов с рекомбинантными плазмидами
3.9. Электрофорез ДНК
3.10. Перенос ДНК на нейлоновые фильтры
3.11. Радиоактивное мечение ДНК
3.12. ДНК-ДНК-гибридизация на фильтрах
3.13. ПЦР
3.14. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
3.15. Анализ секвенпрованных последовательностей ДНК
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Использованные в работе коллекции природных штаммов
Л.хиМ/к
4.2. Изучение структуры мелких плазмид
4.2.1. Рестрикционный анализ и классификация мелких плазмид
4.2.1.1. Характеристика мелких плазмид из 19 штаммов мо сковской коллекции
4.2.1.2. Характеристика мелких плазмид из 10 штаммов белорусской коллекции
4.2.1.3. Характеристика штаммов с несколькими мелкими плазмидами
4.2.1.3.1. Штамм 1
4.2.1.3.2. Штамм 1
4.2.1.3.3. Штамм 1
4.2.2. Определение нуклеотидной последовательности мелких плазмид
4.2.2.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды р 1
4.2.2.2. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды р 1516S
4.2.2.3. Определение нуклеотидной последовательности EcoRl-Hindill
фрагмента плазмиды р 1516L
4.2.3. Поиск гомологов ряда плазмидных генов среди штаммов
бактериальных коллекций
4.2.3.1. Гибридизация с зондами - участками генов
4.2.3.2. Наличие гомологов IS5s/(2 в хромосомной ДНК штаммов B.subtilis
4.3. Анализ крупных плазмид
4.3.1. Характеристика крупных плазмид из московской
коллекции и р19 из белорусской коллекции
4.3.1.1. Поиск крупных плазмиды в штаммах B.subtilis. Размеры плазмид
4.3.1.2. Сравнение обнаруженных крупных плазмид с минирепликоном
плазмиды р19 из белорусской коллекции штаммов B.subtilis
4.3.1.3. Определение способности крупных плазмиды из штаммов
B.subtilis к конъюгативному переносу
4.3.1.4. Характеристика плазмид штамма В.subtilis
4.3.2. Изучение коныогативного переноса, осуществляемого
плазмидой р19 из почвенного штамма B.subtilis
4.3.2.1. Мобилизация мелких неконъюгативных плазмид
4.3.2.1.1. Определяющая роль р 19 в мобилизации pUBl
4.3.2.1.2. Кинетика переноса pUBl 10 при разных температурах
4.3.2.1.3. Мобилизационный перенос pUBl 10 при использовании
различных штаммов B.subtilis
4.3.2.1.4. Перенос pUBl 10 в штаммы разных видов Bacillus
4.3.2.1.5. Мобилизация других неконъюгативных плазмид
4.3.2.1.5.1. Изучение переноса плазмид с сигма-типом
репликации (рВС 16, рС194)
4.3.2.1.5.2. Изучение переноса плазмиды, имеющей тета-репликон

мобилизации мелких плазмид. рВТ9727 мобилизует мелкие плазмиды с частотой на 1-2 порядка ниже, чем pAW63 (Van der Auwera et al., 2008).
Определение нуклеотидной последовательности плазмиды B.thuringiensis рВМВ67 позволило выделить на ней //«-район величиной 39 тпн, включающий 41 предполагаемую ORF. Среди гипотетических белков /га-района рВМВ67 идентифицированы гомологи VirB4-, VirBll-, Vii'04-белков, трансглюкозилазы, релаксазы. Однако эта плазмида изучена только in silico, ее способность осуществлять конъюгативный перенос не показана (Chao et al., 2007). Также in silico была изучена плазмида B.thuringiensis pFR55 (Amadio et al. 2009).
У бактерий группы B.cereus конъюгативный перенос плазмид, вероятно, постоянно происходит в природных условиях. Показан конъюгативный перенос плазмид pXOl и pAW63 в пищевых продуктах, причем частота переноса иногда превышала таковую в лабораторных средах (Van der Auwera et al., 2007). Было показано, что pXOlö может осуществлять как перенос самой себя, так и мобилизацию мелких плазмид и ретромобилизацию в пищевых продуктах (Timmery et al., 2009), в речной воде, личинках насекомых (Thomas et al., 2001). в кишечнике гнотобиотических крыс ( Wilks et al., 2008). Плазмида рНТ73 могла быть перенесена путем конъюгации из B.thuringiensis в различные штаммы B.cereus в почве и в личинках насекомых; в последнем случае частота переноса была максимальна и достигала 1 (Vilas-Boas et al., 1998; Yuan et al., 2007). Сообщалось о мобилизационном переносе в подобных условиях плазмиды рВС16 между штаммами B.thuringiensis за счет конъюгативных систем неидентифицированных плазмид (Thomas et al., 2000).
2.1.6.2.Конъюгация у бацилл группы B.subtilis.
В этой группе конъюгация описана только для одной плазмиды pLS20 из клеток B.subtilis (nattd). Довольно давно было показано, что pLS20 способна осуществлять мобилизационный перенос мелких плазмид S.aureus рВС16 (TcR), pUBl 10 (KmR) и мелкой плазмиды B.subtilis pLS19 (5,4тпн) на поверхности агара с частотой до 10'3. Перенос происходил в штаммы различных видов бацилл: B.anthracis, B.cereus, B.licheniformis, B.megaterium, B.pumilus, B.subtilis, B.thuringiensis. В ряде случаев в трансконъюгантах обнаруживалась плазмида pLS20, т.е. плазмида способна к самопереносу (Koehler, Thome, 1987; Selinger et al., 1990). Позже с помощью гибридной плазмиды pLS20c«/ (CmR) было показано, что плазмида способна к самопереносу как на твердой, так и в жидкой среде.