Генетическая структура нерки, Oncorhynchus nerka (Walbaum), полуострова Камчатка

• Автор: Пильганчук, Оксана Александровна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Петропавловск-Камчатский
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Ареал, краткая биологическая характеристика и внутривидовая

организация нерки

1.2. Генетическая дифференциация нерки Азии и Северной Америки:

состояние изученности данного вопроса

1.2Л. Биохимический полиморфизм

1.2.2. Полиморфизм мтДНК

1.2.3. Изменчивость микросателлитных локусов

1.2.4. Однонуклеотидный полиморфизм (БИР)

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Молекулярно-генетические методы
2.2.2. Методы статистического анализа
ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ НЕРКИ ВОСТОЧНОЙ КАМЧАТКИ
3.1. Характеристика уровня изменчивости микросателлитов
3.2. Пространственная изменчивость аллельных частот
3.3. Межпопуляционная генетическая дифференциация
ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ НЕРКИ ЗАПАДНОЙ КАМЧАТКИ (на примере бассейна р. Озерная)
4.1. Дифференциация сезонно-экологических форм нерки оз. Курильское (бассейн р. Озерная)
4.2. Характеристика дискриминирующей способности микросателлитных
локусов нерки бассейна р. Озерная
4.3. Гетерогенность нерестового хода нерки р. Озерная
ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ТЕМПОРАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ
ГЛАВА 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОРСКИХ СМЕШАННЫХ ВЫБОРОК НЕРКИ НА ОСНОВЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ АЛЛЕЛЬНЫХ ЧАСТОТ
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ
6 Л. Оценка разрешающей способности реперных данных
6.2. Апробация базы реперных данных
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Тихоокеанские лососи (род Опсогкупскт) наиболее значимые в промысловом отношении объекты ихтиофауны для многих государств, расположенных на побережье Тихоокеанского бассейна и, главным образом, России. В 30-40-е годы XX в. их уловы достигали 500-600 тыс. тонн (Кляшторин, 2000). Тихоокеанские лососи относятся к анадромным видам рыб, нерестятся один раз в течении жизненного цикла в реках или озерах, молодь мигрирует в Тихий океан, где нагуливается от одного до пяти лет и возвращается обратно к местам нереста. Представителям этого рода свойственна сложная популяционная организация.
Нерка ОпсогНуп'скш пегка Уа1Ьаит — на территории России третий по численности вид тихоокеанских лососей (Вигрпег, 1991; Синяков, 2006). Наиболее важные и многочисленные стада российской части ареала воспроизводятся на Камчатке, в бассейнах оз. Курильское и р. Камчатка.
Для сохранения и увеличения запасов нерки необходимы детальные и всесторонние исследования популяционных комплексов этого сложно организованного вида, результаты которых позволят разработать рекомендации и создать оптимальные условия для эксплуатации и воспроизводства стад, рационального ведения промысла в прибрежной зоне и нерестовых реках. Полученная информация поможет понять эволюционные закономерности формирования популяционной структуры и видового ареала.
Для регулирования морского промысла на международном уровне, распределения промысловой нагрузки, описания путей миграций, определения происхождения браконьерских уловов необходимо идентифицировать локальные стада разных регионов в смешанных скоплениях молоди и производителей.
В современных условиях одними из самых эффективных и точных методов идентификации являютсд молекулярно-генетические. Анализ на основе аллельной изменчивости микросателлитной ДНК наиболее часто и

стенках подсушивали в открытом виде при комнатной температуре в течение 30-40 мин. Затем, в зависимости от количества, растворяли в 100-500 мкл ТЕ-буфера (ЮгаМ трис-НС1, 2 тМ ЭДТА, pH 7.8), перемешивали на вортексе и оставляли в холодильнике Д=+4 °С) на 12 ч.
На третьем этапе в раствор ДНК добавляли РНК-азу, из расчета: на каждые 100 мкл раствора — 0.5 мкл РНК-азы. Тщательно перемешивали и приблизительно 40—45 мин инкубировали в термостате при ї= +37 °С. Далее добавляли протеиназу-К в том же количестве, что и РНК-азу. Инкубировали в течение 1.5-2.0 ч, при 1= +37 °С. Затем раствор ДІЖ дважды обрабатывали хлороформом, перемешивали на вортексе в течение 10 мин, центрифугировали в указанном выше режиме, отбирали верхнюю фракцию и перемещали ее в новые пробирки. Добавляли 10 мкл ИаС1 и 96%-ый этанол в объеме в 2-2.5 раз превышающем объем ранее добавленного ТЕ-буфера, перемешивали до формирования белой взвеси ДНК. На этой стадии спиртовой раствор ДНК помещали в морозильную камеру и хранили при температуре не выше -40 °С.

Перед проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) спиртовой
раствор ДНК центрифугировали в указанном выше режиме, супернатант аккуратно сливали, осадок ДНК высушивали в течение 30 мин при комнатной температуре и растворяли в ТЕ-буфере (объем от 100 до 500 мкл). До его дальнейшего использования раствор ДНК хранили в морозильной камере (-40 °С).
Для проверки результатов выделения ДНК использовали метод горизонтального электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК в агарозном геле. Для этого готовили пластину 1.2%-ного агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в ІхТВЕ буфере (pH 8.0) агарозу (Маниатис и др., 1984). Гель окрашивали бромистым этидием, сравнивали интенсивность свечения в УФ-свете полос ДНК в анализируемых и эталонных образцах. На некачественную очистку образцов ДНК указывало наличие «шмеров» выше или ниже основной полосы.