Роль тиоловых редокс-систем при действии экстремальных температур и антибиотиков у Escherichia coli

• Автор: Лепехина, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 140 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. ТИОЛОВЫЕ РЕДОКС-СИСТЕМЫ У E. COLI

1.1. Редокс-система глутатиона

1.1.1 Г лутатион

1.1.2 Глутатионредуктаза

1.1.3 Глутаредоксины

1.2. Редокс-система тиоредоксина

1.2.1 Тиоредоксины
1.2.2 Тиоредоксинредуктаза
1.3. Функциональная связь между редокс-системами глутатиона и тиоредоксина
ГЛАВА 2. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС У БАКТЕРИЙ
2.1. Источники АФК и повреждения, вызываемые окислительным стрессом
2.2. Механизмы защиты от окислительного стресса
2.3. Адаптивный ответ на окислительный стресс
2.4. Роль тиоловых редокс-систем при окислительном стрессе
ГЛАВА 3. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ НА БАКТЕРИИ
3.1. Молекулярные механизмы действия антибиотиков
3.1.1 Ингибиторы процессов образования клеточной стенки бактерий
3.1.2 Ингибиторы процессов биосинтеза белка
3.1.3 Ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК
3.2. Гипотеза об окислительном стрессе как универсальном механизме бактерицидного
действия антибиотиков
ГЛАВА 4. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ СТРЕССЫ У БАКТЕРИЙ
4.1. Тепловой стресс
4.1.1. Характерные изменения в клетке при повышении температуры
4.1.2. Адаптивный ответ на тепловой стресс
4.1.2.1. Белки теплового шока
4.1.2.2 Регуляция ответа на тепловой шок
4.1.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при тепловом
стрессе
4.2. Холодовой стресс
4.2.1. Характерные изменения в клетке при резком понижении температуры
4.2.2. Белки холодового шока
4.2.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при холодовом
стрессе
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
5.1. Бактериальные штаммы
5.2. Питательная среда и условия культивирования
5.3. Определение устойчивости бактерий к стрессовым воздействиям
5.4. Определение способности к образованию биопленок
5.5. Определение подвижности бактерий
5.6. Измерение внутри- и внеклеточной концентрации глутатиона

5.7. Определение уровня дисульфидов в белках
5.8. Определение концентрации перекиси водорода
5.9. Определение активности гидропероксидаз HPI и HPII
5.10. Определение экспрессии антиоксидантных генов (по активности [3-галактозидазы)
5.11. Статистическая обработка полученных результатов
5.12. Материалы
ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, МУТАНТНЫХ ПО
ТИОЛОВЫМ РЕДОКС-СИСТЕМАМ
6.1. Рост и выживаемость бактерий
6.2. Способность к образованию биопленок
6.3. Подвижность бактерий
6.4. Концентрация внутри- и внеклеточного глутатиона
6.5. Уровень тиолов и дисульфидов в белках
6.6. Концентрация пероксида водорода в культуральной среде
6.7. Активность гидропероксидаз HPI и HPII
6.8. Экспрессия генов katG и sodA
6.9. Устойчивость бактерий к пероксидному стрессу
ГЛАВА 7. РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA
COLI НА ТЕМПЕРАТУРНЫЕ СТРЕССЫ
7.1. Рост и выживаемость бактерий при температурных стрессах
7.2. Влияние температуры культивирования на способность к образованию биопленок
7.3. Продукция пероксида водорода при температурных стрессах
7.4. Экспрессия антиокисдантных генов при температурных стрессах
ГЛАВА 8. РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA
COLI НА ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ
8.1. Минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков
8.2. Рост и выживаемость бактерий при действии антибиотиков
8.3. Влияние искусственных изменений уровня глутатиона внутри и снаружи клеток на
устойчивость Е. coli к различным антибиотикам
8.4. Комбинированное действие антибиотиков и температурных стрессов
8.5. Способность к образованию биопленок в присутствии антибиотиков
8.6. Влияние экзогенных антиоксидантов на способность к образованию биопленок
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АДФ.......аденозин-5'-дифосфат
АТФ.......аденозин-5'-трифосфат
АФК.......активные формы кислорода
КОЕ.......колониеобразующая единица
м.в.......молекулярный вес
НАДН .... никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАД+......никотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДФН . . никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
НАДФ+ . . . никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
OD боо •• • оптическая плотность (optical density) при длине волны 600 нанометров
ФАД.......флавинадениндинуклеотид
ЭДТА .... этилендиаминтетрауксусная кислота
DTNB .... 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic)) кислота
GOR.......глутатионоксидоредуктаза (glutathione oxidoreductase)
GSH.......глутатион восстановленный
GSSG......глутатион окисленный
HPI.......каталаза гидропероксидаза I (hydroperoxidase I)
HPII......гидропероксидаза II (hydroperoxidase II)
NEM.......N-этилмалеимид (N-ethylmaleimide)
OxyR......транскрипционный фактор, активируемый пероксидом водорода
SOD.......супероксиддисмутаза
SoxRS . . . .сенсорный и регуляторный белки ответа на супероксидный стресс

семейства Hsp60, GroEL и GroES. Суть функции белка GroEL состоит в изменении кинетического баланса между правильным фолдингом, ошибочным сворачиванием и агрегацией [Ткаченко, 2012]. Четырнадцать субъединиц белка GroEL формируют структуру, имеющую центральную полость. Белок, который должен быть свернут, временно размещается в этом отверстии, где с помощью белка GroES приобретает правильную простанственную укладку зрелого белка [Hartl et al., 2011].
У прокариот за распознавание субстрата отвечают сами протеазы, поэтому обычно их в клетке несколько. Сигналом для связывания и гидролитической активности протеаз служат аминокислотные остатки, расположенные на N-конце белковой молекулы [Varshavsky, 1997]. У E. coli известны четыре типа АТФ-зависимых протеаз.
- ClpAP и ClpXP представляют собой крупные олигомерные комплексы, состоящие из шаперонных (С1рА и С1рХ) и протеазных (С1рР) субъединиц [Clarke, 1996]. ClpA и ClpX способствуют развертыванию белка-субстрата и переносят его к протеазному компоненту С1рР, находящемуся во внутренней камере олигомера. Структура С1рР представляет собой образованную двумя гептамерными кольцами полость, располагающую в себе 14 протеолитических активных сайтов [Wang et al., 1998].
- ClpYQ/HsIUV является многокомпонентной протеазой, в состав которой входит Clp-АТФаза, связанная с протеолитическим компонентом, родственным протеасоме эукариот [Ткаченко, 2012].
- HUB (FtsH) - Zn и АТФ-зависимая протеаза, находящаяся в опероне с RpoEt-зависимым промотором. Она участвует в деградации цитоплазматических и мембранных белков [Tomoyasu et al., 1995]. Является единственной АТФ-зависимой протеазой, существенной для жизни E. coli.
- Lon - гомотетрамер, который транскрибируется с промотора теплового шока. Белок имеет два домена: протеазный с карбоксильного конца и АТФазный. В основном Lon протеаза взаимодействует с множеством аминокислот, обогащенных ароматическими остатками, которые становятся доступными в