Биологический синтез олигомеров хитина и их терминально деацетилированных производных с помощью ферментов клубеньковых бактерий

• Автор: Леппянен, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Содержание
Условные обозначения и сокращения
Введение
Г лава 1. Обзор литературы
Часть 1. Биосинтетический способ получения широкого спектра соединений в клетках микроорганизмов, растений и животных
1.1. Биологический синтез в клетках микроорганизмов
1.2. Использование трансгенных растений для получения биологически активных соединений
1.3. Особенности использования животных систем для синтеза биологически активных соединений
Часть 2. Физиологическая роль олигосахаридов как универсальных сигнальных регуляторов межклеточного и межорганизменного взаимодействия
2.1. Функции олигосахаридов, состоящих из остатков аминосахаров - Б-глюкозамина,
1>галактозами на, 1Ч-ацетил-В-глюкозамина и БГ-ацетил-Б-галактозамина
2.2. Биологическая активность хитоолигосахаридов
Часть 3. Основные способы получения хитоолигосахаридов
3.1. Химический и ферментативный гидролиз полимеров хитина и хитозана
3.2. Химический синтез хитоолигосахаридов
3.3. Ферментативный синтез хитоолигосахаридов
Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.2. Условия культивирования микроорганизмов
2.3. Растительный материал
2.4. Условия выращивания растений
2.5. Олигонуклеотиды, ферменты и векторы для клонирования
2.6. Компьютерные и интернет-ресурсы
2.7. Выделение ДНК бактерий

2.8. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные гены nodC двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и М. loti 1
2.9. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные гены nodC и nodB М. loti 1
2.10. Определение нуклеотидных последовательностей генов
2.11. Экспрессия белков в клетках Е. coli. Приготовление экстрактов клеток Е. coli и выделение различных субклеточных фракций
2.12. Электрофорез белков в ПААГ и Вестерн-блот гибридизация
2.13. Синтез хитоолигосахаридов ш vivo
2.14. Выделение хитоолигосахаридов
2.15. Разделение хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ)
2.16. Анализ синтезированных хитоолигосахаридов с помощью метода масс-
спектрометрии
2.17. Анализ деацети лированных олигомеров хитина методом тонкослойной
хроматографии
2.18. Выделение РНК растений
2.19. Анализ экспрессии генов Pal томата и гороха методом полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и определением продуктов реакции в реальном времени
2.20. Определение содержания перекиси водорода в корнях растений
2.21. Анализ влияния олигомеров хитина на рост фитопатогенного гриба Fusarium culmorum
2.22. Выделение ДНК растений
2.23. Оценка интенсивности заражения растений
2.24. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и обсуждение
Часть 1. Ферментативный синтез гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов с помощью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобий
3.1. Гстерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном nodC, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и М. loti 1803
3.2. Синтез хитоолигосахаридов в культивируемых клетках Е. coli и анализ этих соединений

Часть 2. Анализ биологической активности хитоолигосахаридов, полученных биосинтетическим способом
3.3. Тестирование элиситорной активности хитоолигосахаридов
Часть 3. Биосинтез терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хигоолигосахарид деацетилазы.
3.4. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные последовательности генов nodC и nodB М. loti 1
3.5. Синтез деацетилированных по терминальному положению хитоолигосахаридов с помощью ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы М. loti 1
3.6. Анализ синтезированных терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов методом тонкослойной хроматографии
Заключение
Выводы
Список литературы Благодарности

Хитиназы (гликозилгидролазы) широко распространены в живых организмах. У высших растений хитиназы защищают от различных патогенов и вредителей (Журавлева, Лукьянов, 2004). У насекомых и ракообразных хитиназы отвечают за гидролиз хитина кутикулы в период линьки. У микроорганизмов хитиназы участвуют в деструкции хитинсодержащего субстрата, либо в синтезе клеточной стенки (главным образом, у грибов) (Журавлева, Лукьянов, 2004). Свойства хитиназ были изучены у бактерий Streptomyces, Bacillus, Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Cytophaga, а также грибов Aspergillus, Pénicillium, Paecilomyces.
Согласно общепринятой номенклатуре выделяют два типа хитиназ: эндохитиназу (КФ 3.2.1.14) и N-ацетилы-глюкозам инидазу (экзохитиназу, КФ 3.2.1.30) . Эндохитиназа расщепляет полимерную цепь в случайных местах, а N - а цет и л - ß - г л юко зам и н и даз а отщепляет концевые остатки N-ацетилглюкозамина (Журавлева, Лукьянов, 2004). Продуцентами хитиназ являются Streptomyces kurssanovii (Ильина и др., 1993; Ильина и др., 2000), Trichoderma reesei (Ильина и др, 2002), Serracia marcescens, Bacillus sublilis (Ильина и др, 2001). В расщеплении хитозана участвует другой фермент хитозаназа (КФ 3.2.1.132). Этот фермент расщепляет связь между остатками двух глюкозаминов и не расщепляет связь между остатками N-ацетилглюкозамина (Dinter et al, 2000).
Ферментативный гидролиз является более мягким способом, который позволяет сохранить структуру получаемых соединений по сравнению с химическим способом. Однако хотя при этом могут быть получены низкомолекулярные производные с более определенной структурой, все же продуктом реакции является смесь соединений, требующая дальнейшего фракционирования и очистки.
3.2. Химический синтез хитоолигосахаридов.
Химический синтез хитоолигосахаридов проводят с использованием полимерных носителей (твердофазный синтез) для целенаправленной региоспецифической сборки олигосахаридов, а также проводят синтез в жидкой среде (Новиков, 2003). Твердофазный синтез олигосахаридов включает иммобилизацию на носителе первого мономера, с которого начинается наращивание олигосахаридной цепи. При этом последовательное присоединение следующих мономеров проводят с помощью гликозилирования. Это позволяет получать соединения, в которых мономеры соединены гликозидной связью, при этом снятие синтезированной молекулы олигосахарида с полимерной подложки происходит без нарушения его структуры (Кочетков, 2000). В твердофазном синтезе используют нерастворимые твердые носители (полиакриламидные гели или стекла с контролируемой пористостью), а также некоторые растворимые полимеры