Биологические эффекты бациллярных протеиназ

• Автор: Данилова, Юлия Васильевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 114 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Классификация и свойства микробных протеиназ
2. Характеристика протеиназ Bacillus pumilus 7Р
3. Микробные ферменты в биотехнологии
4. Применение микробных ферментов в медицине
5. Механизмы тромбообразования
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Штаммы и плазмиды
2. Условия культивирования бактериальных штаммов
3.Определение протеолитической активности
4. Выделение и очистка протеиназ
5. Определение тромболитической активности протеиназ
6. Определение активности плазминогена под действием протеиназ
7. Антикоагулянтная активность ферментов
8. Фибринолитическая активность протеиназ
9. Гидролиз фибриногена под действием протеиназ
10. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF) гидролизатов фибриногена
металлопротеиназу-9 (желатиназу-В)
12. Расщепление |3-амилоидного пептида бактериальными протеиназами
13. Изучение влияния бактериальных протеиназ на инфицирование
клеток культуры ткани аденовирусом
14. Определение токсичности протеиназ в отношении микроорганизмов
15. Оценка цитогенетической активности протеиназ в микроядерном тесте
16. Определение токсического действия протеиназ на клетки эукариот
17. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Выделение и очистка протеиназ В. ритНиз 7Р, секретируемых рекомбинантным штаммом В. зиЫШз
2. Тромболитическая активность бактериальных протеиназ
3. Исследование действия ферментов В. ритИт на активность плазминогена
4. Фибринолитическая и антикоагулянтная активность исследуемых бациллярных протеиназ
5. Действие бациллярных протеиназ на матриксные металлопротеиназы-9 (ММП-9) разных клеточных линий
6. Гидролиз р-амилоидного пептида протеиназами В. ритИш
7. Влияние протеиназ В. ритИия на инфицирование клеток аденовирусами
8. Токсичность бациллярных ферментов в отношении про- и
эукариот
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
В современном мире сердечнососудистые и онкологические заболевания, а также болезнь Альцгеймера являются наиболее частыми причинами смерти. Лечение этих грозных заболеваний представляет одну из актуальных проблем медицины. Дефицит сырья животного происхождения и, как следствие, недоступность ферментных препаратов в необходимых количествах для медицинской практики, а также их высокая стоимость, стимулируют разработку новых терапевтических средств микробного происхождения.
Особое внимание исследователей привлекают белки и ферменты, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами (Kamiya et al., 2010). В настоящее время получили распространение препараты на основе микробных белков - стрептокиназы и стафилокиназы, которые обладают токсичностью и вызывают побочные эффекты при лечении (Kumar et al., 2013). Для медицинской практики перспективны бактериальные протеиназы, обладающие высокой стабильностью и низкой патогенностью. К таким относится препарат на основе субтилизиноподобной протеиназы B.subtilis Тромбовазим, обладающий высокой эффективностью и низкой токсичностью (Вышлов с соавт., 2006). Это указывает на перспективность применения микробных протеиназ в качестве тромболитических средств. Открытие огромного количества бациллярных протеиназ, изучение механизмов экспрессии их генов и биохимических свойств оставляют немало вопросов относительно биологической активности этих ферментов. В связи с этим представляют научный и --^пракч'=ический=ин-тере<^ибедедавШМ^фибрйНбяйтечеекиХ'^=тромбблйтическго^ антикоагулянтных свойств протеиназ, выяснение их влияния на культуры клеток, а также изучение активности протеиназ по отношению к таким жизненно важным белкам организма, как матриксные металлопротеиназы и бета-амилоид.
Целью работы являлось исследование биологических эффектов бактериальных протеиназ Bacillus pumilus 7Р с различной специфичностью.

Нормальный
сосуд

Эндотелиальная -дисфункция /
Стабильная
бляшка
Заживленная бляшка fSM

Воспаление
Ишемия, некроз
Уязвимая бляшка Дестабилизация разорванной бляшки бляшки
Рисунок 12. Схема образования нестабильной атеросклеротической бляшки.
Фармакологические препараты для лечения атеросклероза (антигиперлипидемические препараты) делят на пять классов по механизму действия: секвестранты желчных кислот (холестипол, холестирамин, квестран и др.); производные фиброевой кислоты, или фибраты (безофибрат, клофибрат, гемфиброзил, фенофибрати др.); препараты никотиновой кислоты; пробукол в единственном числе; конкурентные ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы, или статины (аторвастатин, симвастатин, ловастатин, правастатин, церивастатин, флувастатин).
Наиболее оптимальными являются статины, способные эффективно тормозить процесс развития атеросклероза (Illingworth, 1996). Механизм действия статинов - ингибирование ферментативного синтеза эндогенного холестерина.
_Статины.-замедляют—рост—атеросклеротическй-х--бД^шеК“-йШ—способствую-!'—их-
распаду, снижая уровень атерогенных липопротеидов в крови (Baldassarre et al., 2009; Ballantyne et al., 2012). Статины, инактивируя макрофаги, уменьшают продукцию в них металлопротеиназ (коллагеназ, желатиназ и стромелизина), которые разрыхляют и дестабилизируют атеросклеротическую бляшку.