Антиапоптозные белки – мишени для поиска новых антихламидийных препаратов

• Автор: Борцов, Петр Александрович
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 73 с. : 46 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биология хламидий

1.1.1. Геносистематика и таксономия хламидий

1.1.2. Строение и жизнедеятельность хламидий

1.1.2.1. Строение клеточной оболочки и антигенные детерминанты хламидий

1.1.2.2. Секретируемые факторы хламидий

1.1.2.2.1. Система секреции III типа хламидий

1.1.2.2.2. Секретируемые факторы хламидий вне системы секреции III типа

1.1.3. Жизненный цикл хламидий
1.Т.3.1. Ранний этап внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий
(стадия инвазии)
1.113.2. Средний этап внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий (стадия активного деления)
1.1.3.3. Поздний этап внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий (завершение внутриклеточного этапа развития)
1.2. Апоптоз эукариотической клетки*
Р.2.1. Сигнальные пути индукции и реализации апоптоза
112.2. Регуляция апоптоза транскрипционным фактором р
1.2.3. Сигнальные пути, негативно регулирующие процесс апоптоза
112.3.1. Р13-КММ сигнальный путь
1.2.3.2. Транскрипционный фактор ОТ-кВ
112.3.3. Антиапоптозные белки субсемейства Вс1-2'
1.3. Регуляция апоптоза бактериями
1.3.1. Антиапоптозная активность хламидий
1.З.1.Г. Роль Ысв в антиапоптозной активности хламидий
1.3.1.21 Диацилглнцерин, как фактор антиапоптозной активности хламидий..
1.3.1131 Активация МАРК- сигнального пути
1.3.1.4. Роль СРАБ в антиапоптозной активности хламидий
1.3.1.5. Значение ОТ-кВ в антиапоптозной активности хламидий

1.3.2. Проапоитозная активность хламидий
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1'. 1- Клеточные линии
2.1.2. Штаммы хламидий
2.1.3. Лабораторные животные
2.2. Культуральные методы
2.211 Культивирование клеток
2.2.1.1. Культивирование клеток НЕК-293 и НСТ-
2.2.112. Культивирование клеток McCoy
2.2.2.' Получение инфекционного материала
2.2.2.1. Получение инфекционного материала C.trachomatis
2.2.2.2Получение инфекционного материала C.muridarum
2.3. Методы оценки уровня-инфекции
2.3.1. Флуоресцентная микроскопия (оценка процента инфицированных клеток
и уровень апоптоза)
2.3.2: Модификация метода-ИФА для количественного учета развития хламидийной инфекции
2.4. Методы.оценки уровня апоптоза и выживаемости
214.1. ONPG тест (оценка активности Р-галактозидазы)
2.4.2 Измерение уровня касназ 3 и
2.4.3. МТТ-тест
2.4.4. Окраска метиленовым синим
2.5. Цитометрическая.оценка процента инфицированных хламидиями клеток и. уровня апоптоза
2.6. Эксперименты in. vivo
2.7. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние хламидийной инфекции на митохондриальный, путь апоптоза
3.1.1. Оценка влияния C.trachomatis на апоптоз на различных этапах развития инфекции в условиях индукции митохондриального апоптоза
3.1.2.Количественная оценка развития хламидийной инфекции и уровня
апоптоза на фоне индукции апоптоза стауроспорином
3.13. Оценка уровня активности каспаз в инфицированных C.trachomatis клетках на фоне индукции стауроспорином
3.2. Влияние инфекции C.trachomatis на транскрипционный фактор NF-kB

3.2.1 Влияние хламидииной инфекции на активность NF-kB
3.2.2 Влияние структурных компонентов C.trachomatis на активность NF-kB через Толл-подобные рецепторы
3.3. Влияние C.trachomatis на белок р
3.3.1 Индукция активности белка р53 в зависимости от дозы 5-фторурацила на фоне инфекции
3.3.2 Влияние инфекции C.trachomatis на функциональную активность белка р
на различных этапах развития инфекции
3.3.3. Определение выраженности эффекта подавления функциональной активности белка р53 от дозы инфекции, вызванной C.trachomatis
3.3.4 Оценка уровня белка р53 в клетках на фоне инфекции, вызванной
C. trach о mat is, м етод ом >'Wes tern • В lot
3.3.4 Влияние активности белка р53 на развитие инфекции C.trachomatis в-
культуре клеток
3.3.5. Оценкаразвития спонтанного апоптоза в культуре инфицированных
клеток НСТ-116 дикого типа (wt) и нокаутпых по гену белка р53 (-/-)
3.3.6.. Оценка'влияния активности белка р53 на развитие хламидийной инфекции » условиях in vivo
3.4. Взаимодействие хламидий с протеинкиназой В (Akt сигнальным путем)
3.4:1. Активация Akt на различных этапах развития инфекции
3.5. Выявление новых мишеней для действия лекарственных препаратов, направленных на борьбу с хроническими инфекциями, на основе идентифицированных молекулярных механизмов подавления,хламидиями апоптоза
3.5.1. Выбор III транспортной системы хламидий в качестве мишени для-инактивации,антиапоптозной активности патогена
3.5.1.1. Оценка влияния химического соединения LHC-709-на апоптоз
инфицированных C.trachomatis клеток
3.5.1.2. Оценка влияния ингибитора ССТТ на внутриклеточный жизненный цикл;
3.5.2. Модуляция активности эндогенных сигнальных путей, ответственных за устойчивость к апоптозу, с которыми взаимодействуют патогены
3.5.2.1. Оценка токсичности ресвератрола для клеток
3.5.2.2 Влияние ресвератрола на апоптоз клеток, инфицированных^
C.trachomatis
З.5.2.2.1. Оценка уровня апоптоза методом люминесцентной микроскопии
при окраске пропидиумом иодидом
3.5.2.2.2.0ценка уровня апоптоза- методом проточной цитометрии
3.5.2.2.3. Оценка влияния ресвератрола на активность каспазы-

что CPAF индуцирует протеолиз циклина В и существенно снижает уровень CDK1, препятствуя тем самым развитию апоптозной реакции. [9,160]
Второй мишенью CPAF является PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) - белок в процессах репарации ДНК и развитии апоптоза. Данный фермент участвует в уничтожении поврежденной ДНК, препятствуя ее репарации, что приводит к гибели клетки. Установлено, что CPAF подвергает PARP протеолизу и существенно сокращает концентрацию данного фермента в клетке. [33,85]
Исследования, проведенные на клеточной линии HeLa, выявили, что CPAF способствует ингибированию апоптоза, развивающемуся как по внешнему, так и по внутреннему пути, под действием специфических индукторов. И данный эффект обусловлен именно подавлением указанных выше факторов.
Таким образом, CPAF является одним из основных факторов антиапоптозной активности хламидий, обусловливающим реализацию спектра механизмов подавления' апоптоза инфицированных клеток, а также направленных на защиту патогена от элиминации со стороны иммунной системы макроорганизма.
1.З.1.5. Значение NF-кВ в антиапоптозной активности хламидий Исходя-из возможных путей подавления апоптоза. в клетке, было изучено влияние хламидий на активность транскрипционного фактора NF-кВ и антиапоптозных белков семейства Вс1-2. Установлено, что данные факторы' не активируются С.trachomatis и С.pneumoniae в процессе внутриклеточного развития,, сопряженного с ингибированием апоптоза.
Результаты исследований, проведенных на клеточной линии HeLa, свидетельствуют о том, что патоген не вызывает активации NF-кВ. и локализации данного фактора в ядре в условиях индукции апоптоза TNFa, а также не стимулирует фосфорилирование и деградацию фактора IkBq. Кроме того, не было отмечено усиления- транскрипционной регуляции генов TRAFs, Bcl-2 и Bcl-xL в процессе развития хламидийной инфекции.[152] Тем не менее, данный транскрипционный фактор играет важную роль в антиапоптозной активности C.pneumoniae в случае инфицирования патогеном моноцитов. Это было показано на модели, заражения клеточной линии Mono Mac 6, когда в присутствии протеосомного ингибитора MG-132, подавляющего ДНК-связывающую активность NF-кВ, существенно снижалась экспрессия клеточного ингибитора апоптоза 2 (с-1АР2), которая в норме активируется патогеном по NF-кВ-зависимому пути.[238]
При этом активация NF-кВ отмечена при инфицировании только клеток макрофагально-миелоидного ряда, дендритных и эндотелиальных клеток, но не эпителия. Для перечисленных клеток характерна экспрессия TLR2 и TLR.4, чья роль в активации