Мутационная изменчивость CTX-M β-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli

• Автор: Степанова, Марина Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Смоленск
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ...;
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Общая характеристика р-лактамаз расширенного спектра
Глава 2. Р-лактамазы расширенного спектра СТХ-М типа
2.1. Хронология появления и классификация СТХ-М р-лактамаз
2.2 Филогенетическое происхождение СТХ-М Р-лактамаз
2.3. Особенности генетического окружения 6/астх-м генов
2.4. Мобилизация и перенос ЫаСх-м генов
2.5. Эпидемиология СТХ-М ферментов
2.6. Структурные и функциональные особенности СТХ-М БЛРС
2.6.1. Значение отдельных аминокислот в формировании расширенного спектра активности
2.6.2. Структурные изменения СТХ-М Р-лактамаз, приводящие
к смене фенотипа резистентности
2.7. Биохимические свойства СТХ-М ферментов
2.8. Фенотипы резистентности к Р-лактамам, опередованные продукцией СТХ-М р-лактамаз
2.9. Определение СТХ-М БЛРС при помощи фенотипических тестов .
2.10. Эволюция СТХ-М р-лактамаз
2.11. Роль гипермутабельности в эволюции СТХ-М БЛРС
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1. Общая характеристика и дизайн исследования
4.2. Лабораторные штаммы микроорганизмов
4.3. Клинические штаммы микроорганизмов
4.4. Определение чувствительности клинических изолятов
к антибиотикам
4.5. Фенотипическое обнаружение БЛРС
4.6. Выделение бактериальной ДНК для последующей амплификации
4.7. ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование
генов ß-лактамаз
4.8. Перенос детерминант резистентности с помощью конъюгации
4.9. Изоэлектрическое фокусирование ß-лактамаз
4.10. Типирование клинических штаммов с помошью ПЦР с произвольными праймерами (AP-PCR
4.11. Типирование клинических штаммов с помошью пульс-электрофореза (PFGE) макрорестрикционных фрагментов
геномной ДНК
4.12. Анализ природных плазмид , несущих гены 6/астх-м
4.13. Определение частоты формирования спонтанных мутантов, устойчивых к рифампицинк к рифампицину
4.14. In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов, продуцирующих СТХ-М ß-лактамазы
4.15. Определение копийности плазмид, несущих гены Ыастх-м
Глава 5. Результаты исследования
5.1. Идентификация клинических изолятов, продуцирующих цефтазидим-гидролизующих СТХ-М ß-лактамазы
5.2. Выявление источников происхождения ß-лактамазы СТХ-М-42, гидролизующей цефтазидим.
5.2.1. Молекулярно генетическое типирование клинических
изолятов E.coli
5.2.2. Анализ СТХ-М-кодирующих плазмид E. coli 2320, 2322,
1224 и ихтрансконъюгантов
5.2.3. Выявление фенотипа гипермутабельности у клинических штаммов
E. coli, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-
5.2.4. Подтверждение роли мутации Proi67^Thr в изменении спектра активности СТХ-М БЛРС
5.3. In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов-продуцентов СТХ-М-3
5.4. Влияние копийности плазмид, несущих гены СТХ-М ß-лактамаз, на
уровни резистентности к ß-лактамным антибиотикам
Глава 6. Обсуждение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

сравнению^ с цефтазидимом. Повышенная цефотаксимазная активность обусловлена- уникальной геометрии сайта связывания, которая допускает эффективное взаимодействие с пенициллинами, цефалоспоринами узкого спектра и цефотаксимом, но не с большой молекулой’ цефтазидима (51,88). Изменение субстратной специфичности ферментов СТХ-М-типа возможно в результате точечных мутаций, также как и у ТЕМ и БНУ ферментов (38): В частности, описано некоторое количество СТХ-М ферментов с повышенной активностью в отношении цефтазидима. Появление таких производных может быть связано с естественной селекцией, возникающей при использовании цефтазидима в клинической практике (15,31,48). Основные мутации в этих ферментах локализованы в облети двух структурных элементов, определяющих границы сайта связывания р-лактамов, а именно, в терминальной части ВЗ 13-цепи и в П петле (Рис. 1). Мутации, обуславливающие изменение спектра активности СТХ-М ферментов не были ранее обнаружены у ТЕМ и БНУ БЛРС (98).
Замена Аярг*«)—>С1у в терминальной части ВЗ (3-цепи отвечает за увеличение гибкости р-цепи, делая тем самым активный сайт более доступным для большой молекулы цефтазидима (51), в то время как, замены в П петле, в 167 позиции, вероятно меняют способ взаимодействия Р-лактамов с сайтом связывания (95). В отличие от замены Аэрг-ю—>-Сг1у, которая незначительно влияет на активность ферментов по отношению к другим р-лактамным субстратам (включая цефотаксим), замены в П петле связаны с понижением каталитической активности фермента к другим субстратам (15,31,48), что отражается на соответствующих значениях МПК штаммов-продуцентов. Это может являться причиной большей частоты встречаемости СТХ-М ферментов с заменой Аяр24о—*С1у, по сравнению с мутациями в О. петле, у клинических штаммов.