Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila

• Автор: Тартаковская, Дина Игоревна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila

1Л. 1. Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila

1Л .2. Эффекторные белки L. pneumophila

1.2. Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов

1.3. Гликозилтрансферазы

1.4. Lgt - семейство цитотоксичных глюкозилтрансфераз L. pneumophila

1.5. Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы для синтеза и модификации ДНК
2.1.2. Общелабораторные реагенты
2.1.3. Питательные среды и вещества
2.1.4. Олигонуклеотиды
2.1.5. Радиоактивные материалы
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование микроорганизмов
2.2.2. Выделение ДНК

2.2.3. Постановка ПЦР
2.2.4. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК
2.2.5. Трансформация
2.2.6. Создание делеционных штаммов S. cerevisiae
2.2.7.Определение токсического фенотипа у дрожжей титрационным методом
2.2.8. Экспрессия рекомбинантных белков
2.2.9. Выделение фактора элонгации 1А из клеток S. cerevisiae
2.2.10. Экстракция белков из клеток S. cerevisiae
2.2.11. Получение поликлональных антител
2.2.12. Электрофорез в SDS полиакриламидном геле
2.2.13. Иммуноблоттинг
2.2.14. In vitro трансляция в системе S. cerevisiae
2.2.15. Определение ГТФазной активности
2.2.16. Реакция глюкозилирования
2.2.17. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Глюкозилирующая активность Lgtl в отношении нативного и обработанного трипсином белка EF1A S. cerevisiae
3.2. Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1А
3.3. Идентификация нового субстрата фермента Lgtl - белка Hbsl
3.4. Подавление белкового синтеза ферментом Lgtl и его мутантными формами в системе S. cerevisiae
3.5. Создание коллекций штаммов S. cerevisiae, содержащих мутантные варианты фактора элонгации

3.6. Токсическое действие 1^1 в генетически-сконструированных штаммах
5 сегетАше
3.7. Заключение
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Список использованной литературы

последовательности продуктов этих генов, соответствующие белки были разделены натри группы: Lgtl, Lgt2, Lgt3 (Рис. 2).
В геноме штамма Philadelphia-1 содержатся все три гена: lgtl, lgt2, lgt3, в то время как геномы других штаммов содержат ген lgtl или lgt3. Оказалось, что самый высокий уровень гомологии между группами белков, наблюдается в нуклеотид-связывающем домене, содержащем консервативный DXD мотив (Belyi Y., Stahl М., et al., 2009).
Г ры.-1 Lens Ґ Paris Corby
1 fpgl368 J 4)11319 L ІРРІ322 J ^ tpc0784 _

ipg2S
Г Phi-1 1 Lens Paris Corby
[4>gl488 J [ îpll 540 _ lpp!444 [ lpc0903 J
Рис. 2. Схема семейства ферментов Lgt, включающая три группы. Указаны кодирующие последовательности соответствующих трансфераз у разных штаммов L. pneumophila.
Все исследованные штаммы L. pneumophila содержат в геноме ОРС, кодирующие белки группы Lgtl и Lgt3 (Садретдинова О. В., Люк К., 2012). Глюкозилтрансферазы этих групп имеют разную молекулярную массу, для группы Lgtl она составляет от 60 до 65кД, а для группы Lgt3 - от 87 до ЮОкД. Представитель второй группы - белок Lgt2, присутствует только в штамме Philadelphia-І и его молекулярная масса составляет 70кД (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008).
Все три гена lgtl, lgt2 и lgt3 были клонированы и экспрессированы в модельной системе Е. coli, а очищенные ферменты были протестированы в реакции in vitro глюкозилирования. Все рекомбинантные белки проявляли