Молекулярно-генетический анализ мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам

• Автор: Хахалина, Анастасия Александровна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фторхинолоны. Молекулярно-генетические механизмы развития устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам
1.2. Микробиологическое (фенотипическое) определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам фторхиноло-ного ряда
1.2.1. Определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам па плотных сре-
ф дах
1.2.2. Определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах
1.3. Молекулярно-генетические методы и современные технологии определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к фторхинолонам
1.3.1. Молекулярно-генетические методы с электрофоретической детекцией мутаций, обуславливающих развитие лекарственной устойчивости М. tuberculosis
1.3.2. Молекулярно-генетические методы, позволяющие определять тип мутаций
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА SSCP И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОММЕРЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ^ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ gyrA и gyrR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
2.1. Модификация метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («М-SSCP») для выявления мутаций в гене gyrB ДНК М. tuberculosis, ответственных за устойчивость к фторхинолонам
2.2. Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTRDR.s7» и метода «М-SSCP» в образцах мокроты
ГЛАВА 3. АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ-МИШЕНЯХ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ФТОРХИНОЛОНАМ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

3.1. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «М-SSCP» в культурах М. tuberculosis
3.2. Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости М. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксаци-
3.3. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК М. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и с хроническим течением
процесса
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Современная эпидемическая обстановка по туберкулёзу характеризуется увеличением числа больных, у которых выявляются штаммы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) с множественной лекарственной устойчивостью (МБТ-МЛУ) или широкой лекарственной устойчивостью (МБТ-ШЛУ) как среди пациентов с хроническим течением процесса, так и у впервые выявленных лиц [74].
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - это одновременная устойчивость МБТ к препаратам первого ряда (изониазиду (INH) и ри-фампицину (R1F)). Широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) называют одновременную устойчивость МБТ к основным препаратам первого ряда -INH и RIF и к препаратам второго (резервного) ряда - фторхинолонам и к одному из аминогликозидов и/или капреомицину.
В настоящее время в мире насчитывается около 600 тыс. больных туберкулезом с МЛУ. По данным ВОЗ, доля таких больных возросла с 11% в 2008 г. до 23% в 2012 г. В Российской Федерации (РФ) этот показатель увеличился с 18% до 44% в 2010 г., а доля больных туберкулезом с ШЛУ среди больных с МЛУ возросла с 4% до 19%. В 2012 г. показатель МЛУ среди впервые выявленных больных и больных с хроническим течением туберкулеза составил 3,6% и 20,2% соответственно [63, 79, 87, 115, 116, 117, 118]. Эпидемическая обстановка в Москве также остаётся непростой. Процент больных туберкулёзом с МЛУ среди впервые выявленных в 2009-2011 г. колебался от 12,6% до 14%, в 2012 г. составил 12,8%, а среди контингентов ПТД увеличился с 23,0% в 2008 г. до 30,0 % в 2012 г. [10, 11, 12, 19].
Фторхинолоны являются одними из основных препаратов, используемых для химиотерапии больных туберкулёзом с МЛУ [35, 40, 120, 121]. Наиболее эффективными из них являются препараты четвёртого поколения, такие как моксифлоксацин (МОХ) и гатифлоксацин (GTX), которые показали высокую активность и низкие значения МИК в отношении не только МБТ-
менно использовать несколько ДНК-зондов. Недостаток метода заключается в использовании высокотоксичных химических реактивов.
Метод расщепления гетеродуплексной РНКазой А — mismatch
Является достаточно близким по принципу к СМС-методу. Для образования гетеродуплексов с тестируемой ДНК в качестве зонда используют комплементарную радиоактивно меченую РНК-пробу. Для определения мест нарушения спаривания оснований гетеродуплексы обрабатывают РНКазой А, которая разрушает молекулу РНК, позволяя тем самым точно определить локализацию этих несовпадений. Детекция точечных мутаций так же, как и в случае СМС-метода, проводится после электрофореза и радиоавтографии по размерам образовавшихся фрагментов. Ограничение широкого применения этого метода связано с необходимостью использования радиоактивно меченой РНК-пробы, а также возможность выявлять только 50% точечных мутаций [4, 20, 112].
Метод гетер о дуплексного анализа (ПЦР-ГДА)
В основе метода лежит возможность идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или в гетерозиготном состоянии. Принцип метода заключается в последующем выполнении амплификации небольших фрагментов генов тестируемой и контрольной ДНК, денатурации и медленной рена-турации полученных продуктов ПЦР. В результате одноцепочечные фрагменты образуют или полностью комплементарные гомодуплексы, или если они отличаются хотя бы на один нуклеотид - гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепочками ДНК. Гетеродуплексы, в отличие от гомодуплексов, имеют разную электрофоретическую подвижность за счет кон-формационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов. Для более эффективного разделения гомо- и гетеродуплексов используют различные варианты гелей. Выявление мутаций может осуществляться как с использованием изотопов, так и флуоресцентных красителей. Эффективность выявления мутаций с помощью этого метода достигает 80-90%, если фрагмент ДНК менее 300 п.н. В качестве примера использования этого метода для выявле-