Новые анаэробные термофильные целлюлолитические микроорганизмы

• Автор: Подосокорская, Ольга Андреевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 181 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Список работ, опубликованных по ма териалам диссертации

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Целлюлоза и ее гидролиз

1.1. Структура и свойства целлюлозы

1.2 Ферменты разложения целлюлозы

2. Разнообразие термофильных целлюлолитических микроорганизмов

2.1. Общая характеристика аэробных и анаэробных целлюлолитических микроорганизмов. Термофильные целлюлолитики

2.2. Целлюлолитические грибы. Термофильные представители

2.3. Термофильные целлюлолитические бактерии
2.4. Термофильные целлюлолитические археи
3. Перспективы использования целлюлаз термофильных микроорганизмов
3.1. Области применения целлюлаз
3.2. Термостабильные ферменты и их преимущества перед мезофильными аналогами
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Микробиологические методы
1.1. Объекты исследования
1.2. Отбор проб и полевые работы
1.3. Культивирование термофильных прокариот в лабораторных 54 условиях

36 41
1.3.1. Модифицированная среда Пфеннига
1.3.2. Модифицированная пресная среда Видделя
1.3.3. Модифицированная морская среда М1
1.3.4. Морская среда
1.3.5. Среда Ор1к
1.3.6. Культивирование коллекционных штаммов термофильных 59 прокариот
1.4. Органические субстраты и акцепторы электронов
1.4.1. Приготовление аморфной целлюлозы
1.4.2. Приготовление оксида кристаллического железа (III)
1.5. Выделение чистых культур
1.6. Микроскопия
1.7. Оценка скорости роста
1.8. Определение продуктов роста исследуемых штаммов
2. Биохимические методы
2.1. Определение бактериохлорофиллов и каротиноидов
2.2. Каталазная и оксидазная активность
2.3. Акцепторы электронов
2.4. Ингибиторный анализ
2.5. Спектрофотометрическое определение цитохромов и 66 оксидоредуктазной активности
2.6. Исследование целлюлазной активности
2.6.1. Подготовка образцов
2.6.2. Получение зон просветления с помощью чашечного метода
2.6.3. Динитросалициловый метод определения восстановленных 68 сахаров
2.6.4. Определение сахаров фенол-сернокислотным методом
2.6.5. Ферментативный метод определения целлобиозы
2.6.6. Зимография
3. Хемотаксономические методы

3.1. Определение состава хинонов
3.2. Определение фосфолипидного состава
3.3. Определение состава жирных кислот
4. Геносистематические методы
4.1. Выделение ДНК
4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК
4.3. Детекция продуктов ПЦР
4.4. Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ)
4.5. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных 78 последовательностей
4.6. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей
4.7. Определение суммарного содержания гуанина и цитозина в ДНК
4.8. ДНК-ДНК гибридизация
Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот и первичная 80 характеристика их целлюлаз
2. Новые целлюлолитические бактерии типа Thermotogae
2.1. Thermosipho affeclus sp. nov
2.2. ‘Thermosipho activus ’ sp. nov., штамм Rift-s3
2.3. Fervidobacterium riparium sp. nov
2.4. 'Thermotoga agi lis' sp. nov., штамм 1864opik
3. Новые целлюлолитические бактерии типа Firmicutes
3.1. 'Caldicellulosiruptor kunashiriensis ’ sp. nov., штамм 231 Oopik
3.2. 'Clostridiumparabelense ’ sp. nov., штамм P3M
3.3. 'Clostridium arboreum ’ sp. nov., штамм KK
4. Новая целлюлолитическая бактерия типа Chloroflexi - Ornatilinea 117 apprima gen. nov., sp. nov.
5. ‘Melioribacter roseus ' - умеренно термофильная целлюлолитическая

подходят для обнаружения и выделения таких микроорганизмов, что подтверждают данные об уже описанных представителях. Ниже речь пойдет об известных на сегодняшний день представителях термофильных грибов, бактерий и архей.
2.2. Целлюлолитические грибы. Термофильные представители
Среди 700 аэробных видов отдела Zygomycetes только некоторые виды рода Мисог обладают значительной целлюлолитической активностью. Напротив, гораздо большее разнообразие целлюлолитиков можно наблюдать среди Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes (каждый из отделов содержит свыше 15000 видов) (Carlile & Watkinson, 1997). Помимо аэробных грибов, разлагающих целлюлозу, в микрофлоре желудочно-кишечного тракта крупных травоядных млекопитающих (коров, овец), листоядных птиц (гоацин) и растительноядных насекомых (термиты, черви, личинки) были обнаружены анаэробные грибы, участвующие в разложении растительной пищи, которые классифицируют в б родов: Anaeromyces, Caecomyces, Cyllamyces,
Neocallimastix, Orpinomyces и Pyromyces (Nicholson et al., 2005). В то время как многие грибы способны использовать целлюлозу в качестве источника энергии, только немногие штаммы секретируют комплексы целлюлаз, которые могут иметь практическое применение. Помимо Т. reesei, другие грибы -Humicola, Penicillium и Aspergillus - также способны синтезировать высокий уровень внеклеточных целлюлаз (Schulein, 1997; Jorgensen et al., 2003; Ong et al., 2004).
При этом не следует забывать, что понятие «термофилия» весьма условно, когда речь заходит о грибах. До настоящего времени не было описано ни одного представителя, растущего при температуре выше 60°С (Maheshwari et al., 2000). Большинство так называемых «термофильных» грибов оптимально растут при температуре от 37 до 45°С, с верхним температурным пределом около 50-55°С. К тому же, таких термотолераптных форм не так много: всего около 30 из более чем 50000 видов описанных на сегодня грибов. Среди