Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств

• Автор: Исаков, Михаил Андреевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экзотоксин А

1.2. Современное состояние проблемы по созданию вакцин

против P. aeruginosa

1.2.1. Цельноклеточные вакцины

1.2.2. Липополисахаридные, полисахаридные и полисахарид-конъюгированные вакцины

1.2.3. Вакцины на основе белков жгутиков

1.2.4. Вакцины на основе белков наружной мембраны

1.2.5. Вакцины на основе пилей и системы секреции III типа
1.2.6. ДНК- и вирус-векторные вакцины
1.2.7. Вакцины на основе экзотоксина А
1.2.8. Пассивная иммунотерапия инфекций,
вызываемых P. aeruginosa
1.2.9. Заключение
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Оборудование и материалы
2.1.1. Оборудование
2.1.2. Реактивы
2.1.3. Молекулярно-биологические объекты
2.1.4. Объекты исследования
2.1.5. Экспериментальные животные
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование штаммов A aeruginosa
2.2.2. Выделение геномной ДНК из культуры клеток
2.2.3. Полимеразная цепная реакция
2.2.4. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля
2.2.6. Рестрикция ДНК
2.2.7. Хлороформная очистка ДНК
2.2.8. Лигирование
2.2.9. Приготовление компетентных клеток Е. coli
2.2.10. Трансформация компетентных клеток Е
2.2.11. Выделение плазмидной ДНК
2.2.12. Анализ нуклеотидной последовательности
2.2.13. Получение урацил-содержащей одноцепочечной ДНК
2.2.14. Олигонуклеотид-направленный мутагенез
на одноцепочечной ДНК
2.2.15. Индукция экспрессии рекомбинантных белков
2.2.16. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли
2.2.17. Иммуноблоттинг
2.2.18. Очистка рекомбинантных белков
2.2.19. Иммуноферментный анализ
2.2.20. Иммунизация животных
2.2.21. Определение токсичности экзотоксина А
2.2.22. Определение острой токсичности рекомбинантных белков
2.2.23. Получение сыворотки крови животных
2.2.24. Тест пассивной защиты мышей иммунной сывороткой
2.2.25. Статистические методы
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ЭКЗОТОКСИНА А P. AERUGINOSA
3.1. Получение и клонирование полноразмерной открытой рамки считывания гена toxA
3.2. Создание генно-инженерных конструкций, кодирующих варианты с делецией части гена экзотоксина А
3.2.1 Создание генно-инженерной конструкции рЕТ28-аТох1,2,ДЗ
3.2.2 Создание генно-инженерной конструкции рЕТ28-аТох1
3.2.3 Создание генно-инженерной конструкции рЕТ28-аТох1
3.3. Выделение и очистка белков Тох, аТох1, аТох1,2 и аТох1,2,ДЗ
ГЛАВА 4. ОЦЕНКА ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
4.1. Оценка токсических свойств рекомбинантного
экзотоксина А (ТохА)
4.2. Оценка острой токсичности рекомбинантного
делеционного варианта аТох1,2,ДЗ
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АТОКСИЧНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ЭКЗОТОКСИНА А
5.1. Изучение антигенных свойств рекомбинантных
белков аТох1, аТох1,2, аТох1,2,ДЗ и ТохА
5.2. Изучение протективных свойств рекомбинантных
белков аТох1, аТох1,2 и аТох1,2,ДЗ
5.3. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантных
белков аТох1,2 и аТох1,2,ДЗ
5.4. Изучение иммунного ответа у животных, иммунизированных вариантом аТох1,2,ДЗ
5.5. Изучение защитных свойств иммуных сывороток
к рекомбинантному белку аТох1,2,ДЗ
5.6. Оценка влияния различных адъювантов на протективные свойства атоксичной рекомбинантной формы экзотоксина А аТох1,2,ДЗ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

хронической инфекции P. aeruginosa, вычисленный по относительному риску [68] в группе, завершившей протокол, соответствовал 51%.
1.2.4. Вакцины на основе белков наружной мембраны
По сравнению с серологическим разнообразием О- и Н-антигенов, основные белки наружной мембраны F (OprF) и I (OprI) P. aeruginosa достаточно консервативны [147]. Показано, что данные белки обладают наибольшей иммуногенностью [8]. Следовательно, иммунизация ими может стимулировать образование защитных антител против известных серотипов P. aeruginosa. Для создания вакцин на основе белков наружной мембраны используется как обычная экстракция белков из клеточной биомассы, так и рекомбинантные технологии [72]. Сконструирован гибридный рекомбинантный белок, состоящий из целой молекулы белка OprI, слитой с терминальной аминокислотной последовательностью (190 -342) белка OprF[5, 211]. Слитный белок экспрессировали в растворимой форме в бактериальной системе Е. coli с использованием плазмиды, содержащей дополнительную шестигистидиновую область в N-концевой части рекомбинантного белка, и хроматографически очищали на никель-агарозе.
На животных моделях несколько вакцин показали защитные свойства против синегнойной инфекции. Рекомбинантный белок OprF и гипериммунная сыворотка к нему обладали протективными свойствами при экспериментальной синегнойной инфекции на мышах [6, 9-11]. Вакцина на основе белка OprF защищала крыс от развития глубоких поражений, вызванных легочной синегнойной инфекцией [82], а гибридная рекомбинантная OprF/I вакцина защищала иммунокомпрометированных мышей от внутрибрюшинной инфекции [113, 211]. Химерная белковая вакцина, состоящая из рецепторного и транслокационного доменов ЭТА, OprI и OprF, проявляла защитные свойства на ожоговой модели у мышей [52]. Наконец, на кроличьей модели острой легочной инфекции были