Молекулярная экология метаногенных и метанотрофных архей гидротермальных мест обитания

• Автор: Меркель, Александр Юрьевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Метаиогенные и метанотрофные археи
роль в экосистеме Земли
1.1. Метан
1.2. Метаногенные археи
1.2.1. Метаногенез. Роль и структура Метип-
коэнзим Мредуктазы
1.2.2. Таксономия и филогения метаиогенных
архей
1.2.3. Экология метаногенных архей
1.3. Археи, анаэробно окисляющие метан
1.3.1. Анаэробное окисление метана
1.3.2. Разнообразие и распространение метанотрофных архей
Глава 2. Молекулярный подход в экологии
метаногенных и метанотрофных архей
Глава 3. Гидротермы, как среда обитания
микроорганизмов
3.1. Глубоководные гидротермальные выходы
3.2. Наземные горячие источники
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1. Характеристика мест отбора проб
1.1.1. Диффузные гидротермальные выходы
Тихого океана
1.1.2. Наземные горячие источники Камчатки
и острова Сан-Мигелъ
1.1.3. Отбор образцов
1.2. Молекулярные методы
1.2.1. Выделение нуклеиновых кислот
1.2.2. Электрофорез в агарозном геле
1.2.3. ПЦР
1.2.4. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез
1.2.5. Клонирование
1.2.6. Количественная ПЦР
1.2.7. Секвенирование

1.3. Методы т-эШсо
1.3.1. Первичный анализ полученных
последовательностей
1.3.2. Построение филогенетических
деревьев
1.3.3. Анализ корреляции между относительным содержанием Г+Цпар гена 168рРНК и температурным оптимумом
роста архей
1.3.4. Анализ относительного содержания Г+Цпар гена 168рРНК филотипов
анаэробных метанорофных архей
1.3.5. Разработка и проверка специфичности праймеров на кластер ААТМЕ
1.4. Культуральные методы
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ?3
Глава 1. Молекулярный анализ микроорганизмов диффузных флюидов глубоководных гидротерм на основе гена тег А и 168 рРНК
Глава 2. Детекция термофильных ме ганотрофных
архей с помощью новых систем праймеров
Глвава 3. Оценка разнообразия, распространения и численности метаногенных архей в наземных горячих источниках на основе молекулярных и культуральных подходов
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Процессы образования и окисления метана -это количественно значимые компоненты глобального цикла углерода на Земле и, по-видимому, они являлись таковыми на протяжении всего времени существования биосферы нашей планеты. Тем не менее, далеко не все филогенетические группы микроорганизмов, образующих и окисляющих метан, изучены в достаточной степени.
Процессы метаногенеза и сульфатзависимого окисления метана осуществляются археями, объединенными в родственные группы микроорганизмов, относящихся к типу Euryarchaeota (Strous & Jetten, 2004). Эти микроорганизмы широко распространены в природе, где метаногенные археи осуществляют терминальный этап в процессе анаэробного разложения органического вещества в условиях отсутствия высокопотепциальных акцепторов электронов, тогда как метанотрофные археи в составе синтрофных ассоциаций и при наличии сульфата осуществляют анаэробное окисление метана (Whitman et al,, 2006; Knittel & Boetius, 2009).
Использование гена 16S pPHK для детекции и идентификации метаногенных и метанотрофных архей в сложных микробных сообществах затруднено, поскольку обе эти физиологические группы не являются монофилетичными (Bapteste et al., 2005; Knittel & Boetius, 2009). В связи с этим внимание ряда исследователей было обращено на ген метнл-коэнзим М редуктазы (mcrA) (Springer et al., 2005; Haies et al., 2006). Результаты, полученные во многих работах подтвердили эффективность использования данного функционального и филогенетического маркера для оценки разнообразия и распространения метаногенных и метанотрофных архей (Luton et al., 2002; Hallam et al., 2003).
В экосистемах, ассоциированных с геотермальной активностью, где
водород и метай образуются в результате высокотемпературных абиотических
реакций, метаногенные и метанотрофные археи способны выполнять роль

сходства (Springer et al., 1995; Lueders et al., 2001). Эти свойства гена mcrA делают его применимым для использования не только в качестве функционального маркера, но также и в качестве филогенетического маркера.
На консервативные участки гена метил-коэнзим М редуктазы были разработаны различные праймеры, подходящие для амплификации данного гена из тотальной ДНК большинства метаногенных и метанотрофных архей. На сегодняшний день существует как минимум 15 в той или иной степени универсальных праймеров (Табл. 1.). Все они достаточно сильно вырождены: имеют в своем составе от 3 до 8 вырожденных нуклеотидов.
Помимо универсальных праймеров в экологических исследованиях часто используются праймеры, специфичные к генам 16S рРНК и тсгА представителей определенных групп метаногенов. Так, например, были разработаны различные системы праймеров, специфичные к генам метаногенных представителей отдельных порядков, поскольку они представляют собой хорошо обособленные монофилетические группы микроорганизмов. Были созданы системы 16S рРНК-специфичных праймеров на архей порядков Methanomicrobiales (Yu et al., 2005), Methanosarcinales (Skillman et al., 2004; Yu et al., 2005), Methanobacteriales (Skillman et al., 2004; Yu et al., 2005; Banning et al., 2005), Methanococcales (Skillman et al., 2004; Yu et al., 2005; Banning et al., 2005). Кроме того, на сегодняшний день создано большое число как 16S pPITK, так и шсг/1-специфичных систем праймеров к отдельным родам и семействам метаногенов (в качестве обзора см. Narihiro & Sekiguchi, 2011).
Разрабатываемые системы праймеров используются в различных молекулярных методах, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). В результате с их помощью удается не только изучать распространение отдельных групп микроорганизмов, но и определять структуру и численность микробных сообществ или их составляющих.