Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов

• Автор: Игнатов, Сергей Георгиевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 229 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1 ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1.1 Основы электрооптического метода

1.2 Электрофизические параметры клеток и клеточных

структур

1.3 Физиологические параметры клеток

1.4 Показатели гетерогенности клеточной популяции

1.5 Морфометрические параметры клеток и методы их

измерения

1.5.1 Прямые оптические методы измерения размера клеток

1.5.2 Прямой электрический метод измерения размеров и
концентрации клеток
1.6 Методы измерения поляризационных, электрофизических 27 и электрокинетических параметров суспендированных клеток
1.6.1 Измерение поляризационных и электрофизических
параметров суспендированных клеток
1.6.2 Измерение электрокинетических параметров клеток
1.7 Электрооптический метод анализа клеток
1.7.1 Феноменология электрооптического эффекта
1.8 Применение электрооптического метода для исследования 35 клеток, клеточных структур и биомолекул
1.8.1 Методологические аспекты применения метода
1.8.2 Направления использования электрооптического метода
ГЛАВА 2 БИОСЕНСОРЫ
2.1 Биосенсорные измерения
2.2 Типы биосенсоров
2.2.1 Амперометрические биосенсоры
2.2.2 Сенсоры, основанные на пьезоэлектрических кристаллах
2.2.3 Оптические сенсоры
2.2.4 Биосенсоры на основе фагов
2.3 Иммунологические методы определения бактерий
2.3.1 Получение антител
2.3.1.1 Поликлональные антитела
2.3.1.2 Моноклональные антитела
2.3.1.3 Рекомбинантные антитела
2.3.2 Им му н о ф ер мент иы й анализ
2.3.3 Иммуносенсоры
2.4 Биосенсор для определения антиоксидантной активности
2.4.1 Суиероксид
2.4.2 Патофизиологическая роль свободных радикалов
2.4.3 Механизмы повреждений
2.4.3.1 Липиды
2.4.3.2 Белки
2.4.3.3 ДНК
2.4.4 Защитные механизмы против АФК
2.4.5 Свободные радикалы в биологических системах
2.4.5.1 Повреждения при реперфузии
2.4.6 Определение свободных радикалов
2.4.6.1 Электрохимический метод определения супероксида
ГЛАВА 3 ПРИМЕНЕНИЕ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
3.1 Бионанотехнология,
3.2: Анализ наноорганизации аффинных поверхностей с помощью
зондовой микроскопии
3.2'. 1.. Антитела
3.2.2. Аффинность антител
3.3 Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии
3.3.1 Сканирующая туннельная микроскопия
3.3.2 Атомно-силовая микроскопия
3.4 Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта
3.5 АСМ вирусов
3.6 АСМ бактерий
3.6.1 Нанесение бактериальных клеток на подложку для АСМ
3.7 Изучение взаимодействия фаг-бактерия с помощью АСМ
микроскопии
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 4 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Культивирование микроорганизмов и фагов
4.2 Электрооптический метод
4.2.1 Подготовка клеток к анализу
4.2.2 Измерение ориентационных спектров.клеток
4.2.3 Идентификация микроорганизмов с использованием
электрооптического метода и магнитных частиц
4.3 Биосенсор на основе клеток или мембран
4.3.1 Методика криоиммобилизации
4.3.1.1 Перекристаллизация поливинилового спирта
4.3.1.2 Концентрирование выращенной биомассы
4.3.1.3 Приготовление суспензии клеток или мембран в
растворе гелеобразователя
4.3.1.4 Гранулирование с одновременным замораживанием

4.3.1.5 Реактивация и хранение иммобилизованных клеток или
бактериальных мембран
4.3.1.6. Криоиммобилизация клеток и мембран
4.3.2 Приготовление сенсора на основе кислородного датчика
4.3.3 Тонкопленочные электроды
4.3.4 Биосенсорные измерения антиоксидантных свойств
веществ
4.3.5 Оптический сенсор
4.4 Иммунологические методы
4.4.1 Получение поливалентных сывороток к адено- и ротовирусам
4.4.2 Определение титра антител методом реакции диффузной
преципитации (РДП)
4.4.3 Получение поликлональных антител
4.4.4 Получение и характеристика моноклональных антител
4.4.5 Характеристика кроличьих специфических антител к А
1урЫтигтт-
4.4.5.1 Получение гппериммунной,кроличьей сыворотки
4.4.5.2 Выделение фракций из гипериммунных кроличьих сывороток

4.4.5.3 Дот-блот анализ
4.4.5.4 Тестирование сыворотки
4.4.6 Подготовка латексных частиц для АСМ микроскопии
4.4.7 АСМ микроскопия
4.4.8 Получение макрофагов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 5 ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 6 БИОСЕНСОРЫ
6.1 Бесконтактное определение микроорганизмов
6.2 Биосенсор для определения глюкозы
6.2.1 Глюкозный биосенсор для контроля синтеза авермиктина
6.2.2 Применение глюкозного биосенсора для определения
фенольных соединений
6.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе
бактериальных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизации
6.4 Биосенсоры на основе ЦПМ
6.5 Дормантные клетки как узнающий элемент биосенсора
6.6 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на
основе ЦПМ
6.7 Амперометрический биосенсор для определения
антиоксидантной активности

касалось подбора параметров электрического поля и клеточной суспензии. Для оценки влияния этих факторов использовался визуальный и фотометрический подход. Визуальное исследование поведения клеток в электрическом поле описано в ряде обзоров (Porschke, 1991). Результаты визуального анализа воздействия на клетки электрического поля показали проявление нескольких эффектов: ориентации и цепеобразования в однородном электрическом поле, диполофоретического движения и осаждения клеток на электродах в неоднородном поле (Trusov and-Vojtylov, 1991).
Фотометрические исследования ориентации были выполнены на бактериальных клетках, эритроцитах и ряде других форменных элементов крови. Они показали нелинейный-характер зависимости величины изменения оптической' плотности суспензии, называемой', электрооптическим сигналом, от квадрата напряженности; электрического > поля: (Schwan, 1983). При; увеличении напряженности, поля начальный нелинейный участок переходит в линейный участок зависимости, на котором поляризуемость клеток пропорциональна величине измерения оптической плотности. При последующем увеличении напряженности поля наблюдалось достижение стационарного значения электрооптического сигнала.
Величина электрооптического сигнала связана со значением оптической плотности суспензии нелинейным образом. Функциональная зависимость имеет ярко выраженный максимум. Хотя этот максимум может быть найден теоретически, в ряде работ приведены результаты его эмпирического определения (Хлебцов, 1980).
Электрооптический сигнал имеет ярко выраженную частотную зависимость, которая и используется в последующем для электрофизического анализа исследуемых объектов (Мирошников, 1986; Топ-е and Blumfield, 1981). На форму частотной зависимости электрооптического сигнала влияют тип исследуемых клеток, их возраст, состояние, факторы окружающей среды (Мирошников и др., 1986). На характер функциональной зависимости оказывают воздействие pH среды, ее электропроводность и химический состав,