Разработка препаратов для выявления и идентификации Trichomonas vaginalis

• Автор: Махлай, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Список сокращений, используемых в тексте
АМП - антимикробные препараты
ДЭАЭ - диэтиламиноэтил
ДМСО - диметилсульфоксид
ИППП - инфекции, передающиеся половым путем
ИФА - иммуноферментый анализ
КБК - карбонатбикарбонатный буфер
КПС - концентрат питательной среды
МТЦК - минимальная трихомоноцидная концентрация
5-НИМЗ - 5-нитроимидазол
5-НИТФ - 5-нитрофуран
ОБТК - отдел биологического и технического контроля
ПИФ - прямая иммунофлуоресценция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
СВТ - среда для выявления трихомонад
ФБР - фосфатный буферный раствор
ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор
ФИТЦ - флуоресцеином изотиоцианато
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
18S рРНК - 18S рибосомальная РНК
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений, используемых в тексте
ВВЕДЕНИЕ
ЕЛАВА 1. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА
1 Л. Трихомониаз в структуре ШИШ
1.2. Характеристика возбудителя
1.2.1. Историческая справка, таксономическое положение
1.2.2. Морфология и жизненный цикл клетки
1.2.3. Структура поверхностных белков Т. vaginalis
1.2.4. Метаболизм и культуральные свойства
1.3. Сравнительный анализ лабораторных методов диагностики трихомониаза
1.3.1. Роль микроскопического метода при постановке диагноза
1.3.2. Питательные среды для культурального исследования
1.3.3. Методы, основанные на выявлении антигенов
1.3.4. Диагностическая ценность серологического метода
1.3.5. Методы, основанные на выявлении нуклеиновых кислот
1.4. Лечение трихомонадной инфекции
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты
2.1.1. Культуры микроорганизмов
2.1.2. Антигены для иммунизации
2.1.3. Экспериментальные животные
2.2. Микробиологические методы исследования
2.2.1. Определение количества клеток Т. vaginalis
2.2.2. Определение минимальных трихомоноцидных концентраций противопротозойных препаратов
2.2.3. Определение срока годности при повышенной температуре
2.3. Физико-химические методы исследования
2.3.1. Определение хлорид ионов
2.3.2. Определение концентрации белка
2.3.3. Определение аминного азота
2.3.4. Определение общего азота
2.3.5. Определение идентичности субстанций противопротозойных препаратов
2.3.6. Дезинтеграция клеточной массы Т. vaginalis
2.4. Иммунохимические методы исследования
2.4.1 Получение специфических гипериммунных сывороток
2.4.2. Выделение общеглобулиновых фракций из кроличьих сывороток к трихомонадным антигенам
2.4.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
2.4.4. Получение ФИТЦ-конъюгатов
2.5. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА СЕЛЕКТИВНОЙ БЕССЫВОРОТОЧНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Т. VAGINALIS
3.1. Питательная основа, ее физико-химические свойства и использование для приготовления среды
3.2. Конструирование оптимальной жидкой питательной среды для Т. vaginalis
3.2.1. Влияние дрожжевого экстракта в питательной среде на рост Т. vaginalis
3.2.2. Влияние аминопептида в питательной среде на рост Т. vaginalis
3.2.3. Влияние лизата клеток L-41 в питательной среде на рост Т. vaginalis
3.2.4. Оптимизация состава жидкой питательной среды
3.2.5. Влияние pH на рост Т. vaginalis в жидкой питательной среде
3.2.6. Оптимизация селективной добавки в жидкой накопительной питательной среде
3.3. Оценка ростовых и селективных свойств разработанной питательной среды
3.4. Определение срока годности селективной питательной среды для Т. vaginalis
3.5. Результаты испытания разработанной селективной питательной среды для Т. vaginalis
3.6. Схема приготовления и контроля разработанной питательной среды для выявления Т. vaginalis
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ФИТЦ-КОНЪЮГАТА ДЛЯ ИДЕНТИФЖАЦИИ Т. VAGINALIS
4.1. Получение кроличьих гипериммунных сывороток к трихомонадным белкам
4.2. Выделение иммуноглобулинов
4.3. Маркировка иммуноглобулинов флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ)
4.4. Чувствительность и специфичность полученных ФИТЦ-конъюгатов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в лаборатории биопрепаратов НИИЭМ имени Пастера в период 2008-2011 гг. в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой.
2Л. Объекты
2.1.1. Культуры микроорганизмов
Для разработки питательной среды, получения гипериммунных сывороток и определения минимальных трихомонцидных концентраций использовали эталонные штаммы Т. vaginalis В-7140, В-7141, В-7142 из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».
В опытах по выбору селективного компонента для питательной среды использовали референтные штаммы из американской типовой коллекции культур: Pseudomonas aeruginosa АТСС 25853, Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Candida albicans АТСС 24433. Культуры хранятся в лиофильном виде в ампулах. Перед использование культуры восстанавливали на питательном агаре Мюллера-Хинтон.
Апробацию питательной среды клинический материал, полученный от пациентов, обратившихся в НИИЭМ Пастера в 2007 году с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза и с проблемой бесплодия. Всего было обследовано 93 мужчин и 77 женщин в возрасте от 18 до 56 лет.
Апробацию тест-системы для определения чувствительности Т. vaginalis к противопротозойным препаратам проводили на 109 изолятах Т. vaginalis, выделенных от больных с установленным диагнозом трихомониаз.