Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах

• Автор: Власенко, Анна Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Полисахариды (хитин и пектин) в природных экосистемах
1.1.1. Хитин
1.1.2. Пектиновые вещества
1.1.3. Сферы применения исследуемых полисахаридов
1.2. Отношение почвенных микроорганизмов к температуре
1.3. Гидролитические ферментные комплексы микроорганизмов и их активность в зависимости от температуры
1.3.1. Хитинолитические ферментные комплексы
1.3.2. Пектинолитические ферментные комплексы
1.4. Основные группы почвенных хитинолитических и пектинолитических микроорганизмов
1.5. Молекулярно-биологических анализ хитинолитических сообществ природных экосистем
Глава И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Постановка эксперимента по инициации микробной сукцессии
2.2.2. Изучение эмиссии диоксида углерода из образцов исследуемых почв
2.2.3. Определение численности разных групп микроогранизмов люминесцентномикроскопическим методом
2.2.4. Определение структуры прокариотного хитинолитического и пектинолитического сообщества почв методом FISH
2.2.5. Выделение ДНК и амплификация фрагментов генов 16S рРНК и
с hi А
2.2.6. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез
2.2.7. Филогенетический анализ
2.2.8. Получение и идентификация чистых культур хитинолитических микроорганизмов
2.2.9. Оценка интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов

2.2.10. Определение интенсивности образования хитиназы чистыми культурами микроорганизмов
2.2.11. Определение хитиназной активности in situ
ГЛАВА HI. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Динамика эмиссии диоксида углерода из почв с внесением полисахаридов при различных температурах
3.2. Оптимизация условий разложения хитина с помощью математического планирования эксперимента
3.3. Динамика биомассы хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почв, развивающихся при различных температурах
3.4. Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почве
3.5. Молекулярно-биологический анализ компонентного состава гидролитического бактериального сообщества почв, развивающегося при различных температурах
3.5.1. Исследование прокариотного хитинолитического и пектинолитического сообщества почв с помощью флюоресцентной гибридизации in situ
3.5.2. ДГТЭ-анализ амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК микробных сообществ из почв, обогащенных субстратом и без него
3.5.3. Детекция хитиназного гена chiA в почвах с хитином и без него при различных температурах
3.6. Выделение и идентификация доминантов хитинолитического сообщества ночв, развивающегося при различных температурах
3.7. Оценка интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов при различных температурах
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Такие биополимеры как хитин и пектин являются распространенными полисахаридами в природе и постоянно присутствуют в почве (De Boer, 1999). Хитин представляет собой азотсодержащий полимер М-ацетил-В-глюкозамина, выступает неотъемлемым компонентом клеточных стенок микромицетов, экзоскелета беспозвоночных животных. Пектин -безазотистый полисахарид, состоящий из остатков D-галактуроновой кислоты, является структурным компонентом клеточных стенок высших растений, присутствует в составе клеточных соков. Оба биополимера представляют собой существенный источник углерода и азота для почвенных микроорганизмов, а их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Gooday, 1990; Kang et al., 2005).
Жизнедеятельность гидролитических микробных сообществ в существенной степени определяет уровень плодородия почв, включая снабжение растений доступными питательными ресурсами, формирование почвенной структуры и способность к подавлению нежелательных фитопатогенных популяций (Downing & Thomson, 2000; Kobayashi ct al., 2002). Масштабы микробной деструкции биополимеров (па примере полисахаридов) отличаются в биогеоценозах разных биоклиматических зон. однако в научной литературе информация о структуре и особенностях формирования микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов (в частности, температуры) практически отсутствует. С одной стороны, важна роль психрофильных и психротрофных микроорганизмов в процессах деструкции биополимеров, особенно в зонах холодного и умеренного климата. С другой стороны, известная приуроченность максимальной активности большинства хитинолитических и нектинолитических ферментов микроорганизмов к температуре 40-55°С (Kashyap, 2001; Dahia, 2006) делает интересным вопрос о деструкции полисахаридов почвенным микробным комплексом при повышенных

исследованных ферментов отличалась при их действии на разные субстраты -растворимый и нерастворимый хитин. Сравнительное исследование мезофильных и психрофильных хитиназ методом изотермической калориметрии титрования (Lonhienne et al., 2001а) обнаружило, что обе психрофильные хитиназы А и В проявляли типичное «холодоустойчивое» действие на растворимый хитин, т.е. имели пониженную энергию активации. Однако это не могло способствовать болсс высокой активности этих ферментов при низких и средних температурах. Напротив, мезофильная хитиназа А, выделенная из Serratia marcescens, была в 2 раза активнее психрофильного фермента при 15°С на растворимом хитине. Различия в субстратной специфичности этих трех исследованных ферментов хорошо отображают результаты, полученные во время опытов с нерастворимым хитином (рис. 1.5). На этом субстрате при низких и умеренных температурах психрофильная хитиназа В заметно более активна, чем мезофильная хитиназа А, тогда как психрофильная хитиназа А оказалась слабо активной на нерастворимом хитине. Такое поведение хитиназ может быть объяснено различием в их скорости прикрепления к субстрату. Мавроматис и др. (Mavromatis et al, 2003) отмечает, что адаптация хитиназ к низким температурам коррелирует с незначительными изменениями их аминокислотных последовательностей но сравнению с мезофильньши вариантами.

03 wU

w
0 -т- .
6 10 15 20 75 30 ЗЬ
Temperature (“С)
Рис 1.5. Влияние температуры на каталитическую активность хитиназы А (а) и В (Ь), выделенных из Arihrobacter sp. TAD20 и хитиназы А (с), выделенной из Serratia marcescens при их действии на нерастворимый хитин (по Lonhienne et al., 2001а).
5 10 15 70 75 30 ЗЬ
Temperature (“С)