Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий

• Автор: Мазурова, Ирина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Волгоград
• Количество страниц: 102 с. : 29 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Принципы идентификации и типирования патогенных буркхольде-

рий сравнительным электрофоретическим анализом белков и серологическими методами

1.2 Современное состояние использования серологических и иммуно-

химических методов в дифференциации патогенных буркхольдерий

1.3 Использование иммуноблоттинга в дифференциации патогенных

буркхольдерий

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Штаммы микроорганизмов
2.2 Питательные среды, условия культивирования
2.3 Методы выделения и очистки антигенных комплексов
2.4 Компьютерная и статистическая обработка полученных результатов
ГлаваЗ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ ИМ-
МУНОДИФФУЗИОННЫМИ МЕТОДАМИ
3.1 Унификация методик выделения антигенов
3.2 Изучение возможности применения преципитирующих антигенов
для дифференциации патогенных буркхольдерий
3.3 Изучение возможности дифференциации буркхольдерий в реакции
иммунодиффузии с живыми культурами
3.4 Использование антигенного состава буркхольдерий для дифферен-
циации с помощью иммуноэлектрофореза

Глава 4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕПРЯМОГО МЕТОДА ФЛУОРЕСЦИРУЮ- 61 ЩИХ АНТИТЕЛ С ИММУННЫМИ СЫВОРОТКАМИ К ВНЕКЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНАМ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БУРКХОЛЬ-ДЕРИЙ
Глава 5 ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ИМ- 63 МУННЫХ СЫВОРОТОК К КЛЕТОЧНЫМ И ВНЕКЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНАМ БУРКХОЛЬДЕРИЙ В ТВЕРДОФАЗНОМ ИММУ-НОФЕРМЕНТНОМ МЕТОДЕ
Глава 6 ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СУММАРНЫХ КЛЕТОЧ- 68 НЫХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
6Л Изучение возможности дифференциации буркхольдерий методом
сравнительного анализа спектров суммарных клеточных белков
6.2 Межвидовая дифференциация буркхольдерий и псевдомонад
6.3 Типирование буркхольдерий методом сравнительного электрофоре-
тического анализа
Глава 7 ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО СОСТАВА ПАТОГЕННЫХ БУРК- 83 ХОЛЬДЕРИЙ В ИММУНОБЛОТТИНГЕ
7.1 Характеристика антигенов буркхольдерий
7.2 Различия в составе клеточных антигенов, выявленные в иммуноб-
лоттинге с иммунными кроличьими сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий В. pseudomallei, В. mallei
7.3 Инфравидовая дифференциация буркхольдерий по составу внекле-
точных антигенов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список использованных источников
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аг - антиген Ат — антитело АДФ - аденозиндифосфат БСА - бычий сывороточный альбумин ВСЭ - водно - солевой экстракт ДСН, 808 - додецилсульфат натрия ИБ — иммуноблоттинг ИПК - иммунопероксидазный конъюгат ИФА - иммуноферментный анализ ИЭФ - иммуноэлектрофорез Ккор — коэффициент корреляции мАт — моноклональные антитела м.к. - микробные клетки мол. м. - молекулярная масса МФА - метод флуоресцирующих антител ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция РА - реакция агглютинации РНГА - реакция непрямой гемаггютинации РИД - реакция иммунодиффузии в геле ТИФМ - твердофазный иммуноферментный метод ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота ЭЦА - экстрацеллюлярный антиген - иммуноглобулины кЭа - килодальтон
Щ - относительная электрофоретическая подвижность ЗОБ-РАСЕ - электрофорез в полиакриламидном геле с

Определение количества белка в экстрактах
Концентрацию белка в исследуемых растворах определяли по методу М.М. Bradford [76]. Сущность метода заключалась в связывании протеина с красителем Кумасси G-250. Готовили 6 % раствор Кумасси G-250 в 3 % хлорной кислоте. Перемешивали на магнитной мешалке, фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Для измерения концентрации белка кюветы (контрольная и опытная) соответственно, заполняли растворами с реактивом и измеряемым белком. Пробы выдерживали в течение 20 мин при комнатной температуре. Экстинкцию исследуемых растворов измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны 595 нм, значения концентраций находили по предварительно построенному графику.
Получение иммунных сывороток к антигенам буркхольдернй
Гипериммунные сыворотки к клеточным Аг получали путем иммунизации кроликов с массой тела 2 - 3 кг в возрасте до двух лет.
Для иммунизации кроликов использовали клеточные и внеклеточные Аг. Антиген для иммунизации готовили в объеме 2,0 мл смеси 0,15 М раствора NaCl, pH 7,2 и неполного адьюванта Фрейнда «Difco», (США) в соотношении 1:1. Концентрация Аг составляла 1 мг/мл. Иммунизацию проводили в три цикла. Одно введение состояло из паравертебральных внутрикожных иньекций 0,2 мл приготовленной смеси антигена и адьюванта в 10 точек каждому животному. Интервалы между введениями составляли 7 сут, между циклами — 30 сут. Активность сывороток оценивали после каждого цикла с помощью РИД в геле с антигенным комплексом (разведение 1:2). Животных обескровливали при титре сыворотки по результатам РИД в геле не менее 1:32. После иммунизации и определения титра у иммунизированных животных проводили тотальный забор крови [43].