Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл

• Автор: Тойменцева, Анна Александровна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 145 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Протеолитические ферменты бацилл
1.1.Субтилазы
1.2. Глутамилэндопептидазы бактерий
1.3. Сериновые протеазы В. pumilus
2. Адаптационные процессы в бациллах
2.1. Регуляторная сеть бацилл
3. «Нокаутирование» генетического материала
4. Генно-инженерная биотехнология бактерий
5. Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Штаммы бактерий, плазмидные вектора и условия 53 культивирования
2. Получение рекомбинантных конструкций и работа с ДНК
3. Индукция промотора Р/м/ и определение его активности
4. Western blot анализ
5. Определение протеолитической активности
6. Секвенирование и геноинформатика
7. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Характеристика регуляторных районов генов сериновых
протеиназ В. pumilus
1.1 .In silico анализ регуляторной области генов аргВр и gseBp
1.2. Определение регуляторных участков необходимых для 73 экспрессии генов сериновых протеиназ
1.3. Экспрессия fusion-конструкций в регуляторных мутантах

2. Получение и характеристика штаммов с нокаутированными 81 генами сериновых протеиназ
2.1. Конструирование нокаутированных штаммов В. pumilus
2.2. Описание беспротеазных рекомбинантных штаммов В. 82 pumilus
3. Разработка новой экспрессионной системы для получения 89 гетерологичных белков на основе клеток В. subtilis
3.1. Оптимизация регуляторного участка ІіаІН оперона
3.2. Получение рекомбинантных штаммов В. subtilis для 92 усиления активности Р/,о/ промотора
3.3. Исследование эффективности LIKE-системы в отношении 94 рекомбинантного белка GFP
3.4. Влияние концентрации индуктора на активность P/,a/(0ptsD) 97 промотора
3.5. LIKE-система для продукции генов сериновых протеиназ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Характеристика промоторов генов сериновых протеиназ В. 102 pumilus
2. Характеристика штаммов В. pumilus с инактивированными 107 генами сериновых протеиназ
3. Характеристика новой экспрессионной системы В. subtilis на 112 основе индуцибельного промотора РНа
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложения

(p)PpGpp

WT (wild type)
PEG (polyethylene glycol) M (Met, methionine)
К (Lys, lysine)
D (Asp, aspartic acid)
R (Arg, arginine)
E (Glu, gluetamic acid)
F (Phe, phenylalanine)
A (Ala, alanine)
P (Pro, proline)
n.o.
a.o.

LB (Luria-Bertani medium)
IPTG (Isopropyl (3-D-l-
thiogalactopyranoside)

Taq-полимераза
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

гуанозинтрифосфат гуанозинтетра(пента)фосфат аденозинтрифосфат поверхностно-активные вещества бычий сывороточный альбумин дикий тип полиэтиленгликоль метионин лизин
аспарагиновая кислота аргинин
глутаминовая кислота фенилаланин аланин пролин
пар оснований аминокислотных остатков константа Михаэлиса среда Лурия-Бертони
изопропил-(3-0-1 -тиогалактопиранозид
дезоксирибонуклеиновая кислота рибонуклеиновая кислота аденозинмонофосфат полимеразная цепная реакция термостабильная полимераза из бактерий Ткегтш адиаНсш

последовательную экспрессию трёх других компартмерт-специфичных транскрипционных факторов. Таким образом, активация gf фактора транскрипции является стартовой точкой для запуска ассиметричного деления клеток (образования материнской клетки и предспоры) и локализации SpoOIIE-фосфатазы (индуктора экспрессии sigF гена) на поверхности предспоры [Guberman et al., 2008]. Образование септы сопряжено с процессом временной хромосомной ассиметрии, когда в предспоре оказывается третья часть огг'С-области хромосомы. Такое положение затрудняет экспрессию SpoOIIAB анти-ск фактора в предспоре. В результате происходит активация транскрипция oF фактора, который активирует более 50 генов. Ассиметрия хромосомы важна и в последующих процессах. Так, дальнейшая активация оЕ фактора транскрипции в материнской клетке происходит посредством SpoIIR белка, активирующего процессинг про-оЕ—>аЕ, после продукции его предспорой и секреции через

мембрану (септу). В результате о -зависимой индукции экспрессируются около 300 генов. Впоследствии пока неизвестный сигнал, продуцируемый и передаваемый материнской клеткой в результате активации оЕ фактора, приводит к активации следующего по очереди oG фактора транскрипции предспоры через канал, образованный SpoIIIAH/SpoIIQ белками. В заключении, SpoïVB протеаза под котролем о° фактора транскрипции расщепляет про-ок с образованием зрелого ок фактора в материнской клетке [Lieman-Hurwitz et al., 2009].
«роОА-регулон. Транскрипция гена spoOA происходит с двух промоторов: вегетативного Pv (оА-зависимого) и споруляционного Ps (он-зависимого), последний находится под контролем фосфорилированной формы белка SpoOA. В стационарной фазе роста снимается репрессия с sigH гена и происходит активация киназ. В результате концентрация Spo0A~P белка возрастает, хотя репрессия Ps промотора сохраняется. Процесс смены сигма факторов до конца не выснен. Известно, что до начала стационарной фазы роста транскрипция sigH гена блокируется AbrB репрессором. ДНК-связывающая область промотора гена spoOA содержит четыре консервативных бокса (О, 1-4), соответствующих консенсусу Spo0A~P сайта (5’-TTCGACA-3') [Molle et al., 2003]. Последовательность 0(1) вовлечена в репрессию промотора Pv в стадии перехода к стационару, последовательность 0(2) отвечает за репрессию промотора Р5 во время