Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis

• Автор: Богун, Александр Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 179 с. : ил.

Принятые обозначения и сокращения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

дНТФ - дезоксинулеотидтрифосфат

п.о. - пара оснований

ПДРФ-КбУУО - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов с использованием инсерционной последовательности 6110.

SNP - однонуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide Poly-

morphism)

sSNP - синонимический SNP (synonymous SNP)

nsSNP - несинонимический SNP (nonsynonymous SNP)

SCG - кластерная группа, определённая на основании полимор-

физма единичных нуклеотидов (SNP Cluster Group)
MIRU - рассеянные микобактериальные повторяющиеся участки
(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit)
VNTR - вариабельные тандемные повторы (Variable Number Tan-
dem Repeat)
EMB - этамбутол
INH - изониазид
KAN - канамицин
RIF - рифампицин
STR - стрептомицин
UPGMA - метод невзвешенного попарного среднего, метод попарной
невзвешенной кластеризации (Unweighted Pair Group with Arithmetic Mean)
NJ - метод связывания ближайших соседей (Neighbour-Joining)

Содержание

Введение
Г лава 1. Обзор литературы
1.1 Методы генотипирования микроорганизмов . . . .
1.2 Генотипирование микобактерий туберкулёзного комплекса . .
1.2.1 Сполиготипирование штаммов М. tuberculosis . . . .
1.2.2 ПДРФ-186770 генотипирование штаммов М. tuberculosis . .
] .2.3 MIRU-VNTR генотипирование штаммов М. tuberculosis . .
1.2.4 SNP генотипирование штаммов М. tuberculosis . . . .
1.2.5 Анализ геномных делеций как метод генотипирования
штаммов М. tuberculosis . . . . . . . .
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Бактериальные культуры .
2.2 Питательные среды. . . . . . . . .
2.3 Определение видовой принадлежности клинических бактериальных культур. . . . . . . . .
2.4 Выделение хромосомной ДНК
2.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis
методом MIRU-VNTR
2.5.1 Полимеразная цепная реакция
2.5.2 Определение числа повторов в MIRU-VNTR локусах . . .
2.5.3 Оценка аллельного разнообразия MIRU-VNTR локусов . .
2.5.4 Оценка разнообразия генотипов
2.5.5 Филогенетический анализ клинических
изолятов М. tuberculosis . . . . . . . .
2.6 Анализ точечных мутаций в геномах
клинических изолятов М. tuberculosis . . . . .

2.7 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis
методом ПДРФ-IStf/10.
2.8 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis
методом сполиготипирования
2.8.1 Полимеразная цепная реакция
2.8.2 Гибридизация
2.8.3 Детекция
2.9 Анализ лекарственной устойчивости клинических
изолятов М. tuberculosis
2.9.1 Определение лекарственной устойчивости клинических
изолятов М. tuberculosis in vitro
2.9.2 Изучение мутаций в гене рпсА
2.9.3 Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость
к лекарственным препаратам
Глава 3. Результаты
3.1 Подбор оптимальных условий для амплификации
локусов MIRU-VNTR
3.1.1 Оценка влияния концентрации MgCb на ПЦР . . . .
3.1.2 Изучение влияния дополнительных компонентов на ПЦР . .
3.1.3 Подбор температурных и временных параметров реакции . .
3.2 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих
в Центральном регионе РФ, методом MIRU-VNTR . . . .
3.3 Анализ сполигопаттернов клинических изолятов
М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ . .
3.4 Анализ результатов SNP-типирования клинических изолятов
М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ . .
3.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом ПДРФ-186770 . . . .
3.6 Сравнение данных, полученных при генотипировании

этанола и растворяли в деионизированной воде. Концентрацию ДНК определяли с помощью электрофореза в 0,8 % агарозном геле.
2.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом MIRU-VNTR
2.5.1 Полимеразная цепная реакция
Таблица 3 - Последовательности олигонуклеотидов, использованные для анализа локусов MIRU-VNTR
№ Локус Праймер 1 Праймер
1 VNTR 0154 (MIRU 02) TGGACTTGCACCAATGGACCAACT TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT
2 VNTR 0424 CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC
3 VNTR 0569 TCAGCCTGTTTGTTACCC CTCTCGCCCATACCGGA
4 VNTR 0577 (ETR-C) CGAGAGTGGCAGTGGCGGTTATCT AATGACTTGAACGCGCAAATTGTGA
5 VNTR 0580 (ETR-D, 11RU4) GCGCGAGAGCCCGAACTGC GCGCAGCAGAAACGTCAGC
6 VNTR 0595 (msx.4) GGCGATGTTGATCGGGAT TCTAGACGCCAATCACGС
7 VNTR 0802 (MIRU 40) GGGTTGCTGGATGACAACGTGT GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA
8 VNTR 0960 (MIRU10) GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT
9 VNTR 1443 (Mtubl6) GGTAATCCTGGTCGCTTGTC ACCCAAATTGCCCTGGTC
10 VNTR 1644 (MIRU 16) TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGTA CCCGTCGTGCAGCCCTGGTAC
И VNTR 1895 (QUB-1895) GTGAGCAGGCCCAGCAGACT CCACGAAATGTTCAAACACCTCAAT
12 VNTR 1955 (Mtub21) AGATCCCAGTTGTCGTCGTC CAACATCGCCTGGTTCTGTA
13 VNTR 1982 (OUB-18) CCGGAATCTGCAATGGCGGCAAATTAAAAG TGATCTGACTCTGCCGCCGCTGCAAATA
14 VNTR 2059 (MIRU 20) TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA
15 VNTR 2163a (QUBlla.pUCDIa) CCCATCCCGCTTACCACATTCGTA TTCAGGGGGGATCCGGGA
16 VNTR 2163b (QUB1 Ib.pUCDIb) CGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG CGAAGTGAATGGTGGCAT
17 VNTR 2165 (ETR-A) AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT
18 VNTR 2347 (Mtub29) GCCAGCCGCCGTGCATAAACCT AGCCACCCGGTGTGCCn GTATGAC
19 VNTR 2401(Mtub30) CTTGAAGCCCCGGTCTCATCTGT ACTTGAACCCCCACGCCCATI'AGTA
20 VNTR 2461 (ETR-B) ATGGCCACCCGATACCGCTTCAGTl CG ACG GG CCAT CTTG G ATCA G СГА С
21 VNTR 2531 (MIRU23) CTGTCGATG G CCG CAACAAAA CG AGCTCAACGGGTTCGCCC1TTTGTC
22 VNTR 2687 (MIRU24) CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA
23 VNTR 2996 (M1RU26) TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC CATAGGCGACCAGGCGAATAG
24 VNTR 3007 (MIRU27,QUB-5) TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA
25 VNTR 3171 (Mtub34) GGTGCGCACCTGCTCCAGATAA GGCTCTCATTG CTG G AGGGTTGTA С
26 VNTR 3192 (ETR-E.MIRU31) ACTGATT G G CTTCATACGG CTTT A GTGCCGACGTGGTCTrGAT
27 VNTR 3232 (OUB-3232) TG CCGCCATGTTTCATCAGGATTA A GCAGACGTCGTGCTCATCGATACA
28 VNTR 3239 (ETR-F) CTCGGTGATGGTCCGGCCGGTCAC GGAAGTGCTCGACAACGCCATGCC
29 VNTR 3336 (OUB-3336) ATCCCCGCGGTACCCATC TTCTACGACTTCGCAACCAAGTATC
30 VNTR 3690 (Mtub39) CGGTGGAGGCGATGAACGTCTTC TAGAGCGGCACGGGGGAAAGCTTAG
31 VNTR 3820 TGCGCGGTGAATGAGACG ACCTTCATCCTTGGCGAC
32 VNTR 4052 (OUB-26) AACGCTCAGCTGTCGGAT GGCCAGGTCCTTCCCGAT
33 VNTR 4120 GTTCACCGGAGCCAACC GAGGTGGTTTCGTGGTCG |
34 VNTR 4156 (OUB-4156) TGACCACGGATTGCTCTAGT GCCGGCGTCCATGTT
35 VNTR 4348 (MIRU 39) CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT