Факторы патогенности нехолерогенных штаммов Vibrio cholerae

• Автор: Монахова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 227 с. : 55 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений, используемых в работе

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ГЕМАГГ ЛЮТИНИН/ПРОТЕ АЗ А (НА/Р) И ЦИТОТОКСИН, НЕ ПОВРЕЖДАЮЩИЙ МЕМБРАНУ (NMDCY)

1.1 .Гемагглютинин/протеаза - ключевая протеаза холерных вибрионов

1.2. Клонирование гена hap А в E.coli

1.3. Изучение экспрессии клонированного гена hap А в E.coli и получение препарата НАЛ

1.4. Изучение свойств рекомбинантного белка НАЛ

1.4Л. Гемагглютинирующая активность

1.4.2. Определение протеолитической активности и спектра субстратной специфичности НА/Р

1.4.3. Процессинг биологически активных белков

1.5. Доказательства идентичности НА/Р и NMDCY
1.5.1. Об открытии NMDC Y
1.5.2. Сравнительный анализ литературных и биоинформационных данных о свойствах NMDCY и НА/Р
1.5.3. Изучение биологической активности НА/Р in vitro
1.5.3.1. Морфологические изменения в культурах клеток
1.5.3.2. Ультраструктурные изменения в культурах клеток
1.6. Изучение биологической активности НА/Р in vivo
1.6.1. Изучение активности НА/Р на модели мышей-сосунков
1.6.2. Ультраструктурные изменения тонкой кишки под действием НА/Р
ГЛАВА 2. ЦИТОТОНИЧЕСКИЙ ФАКТОР CEF (СНОУДЛИНЯЮЩИЙ ФАКТОР)
2.1 Клонирование генов cef холерных вибрионов различных серогрупп
2.1.1 Конструирование рекомбинантных плазмид и штаммов E.coli
2.1.2. Изучение экспрессии клонированных генов
2.2 Биоинформационный анализ гена cef и его продукта
2.2.1. Анализ первичной структуры белка
2.2.2. Моделирование вторичной структуры Cef
2.3. Выделение препаратов Cef и изучение их свойств
2.3.1 Выделение Cef с помощью колоночной хроматографии и определение его термостабильности
2.3.2. Биохимическая и биологическая активность препаратов Cef
2.3.3. Изменение свойств Cef после инактивации субстрат-связывающего домена
2.4. Секвенирование гена cef V.cholerae 0139 и биоинформационный анализ его продукта
2.5. Изучение ультраструктурных изменений, вызванных препаратом Cef в культуре клеток L-929 и в кишечнике мышей-сосунков
2.6. ПЦР-детекция гена cef и определение твиназной активности холерных вибрионов
ГЛАВА 3. ТОКСИНЫ, КОДИРУЕМЫЕ ГЕНАМИ ПРОФАГА СТХ, И НЕПОЛНЫЙ СТХ-ЭЛЕМЕНТ
3.1. Филаментозные фаги СТХср и рге-СТХф
3.2. Zonula occludens-токсин (Zot) и дополнительный холерный энтеротоксин (Асе)
3.2.1. Структура и функции Zot и Асе: состояние вопроса
3.2.2. Сравнительный биоинформационный анализ продуктов генов zot и асе, входящих в состав СТХф и рге-СТХф
3.2.3. Клонирование и экспрессия геновzot и асе в E.coli
3.2.4. Изучение биологической активности рекомбинантных белков Zot И Асе-, г
3.2.4.1. Исследования активности Zot и Асе in vitro
3.2.4.2. Исследования активности Zot и Асе in vivo
3.3. Штаммы холерных вибрионов, содержащие профаг рге-СТХ
3.3.1. Выявление генов СТХ-элемента с помощью зондирования
3.3.2. Структура и изменчивость неполного СТХ-элемента
3.3.3. Изучение геномного полиморфизма
3.3.4. Изучение способности холерных вибрионов к образованию репликативных форм и вирионов рге-СТХф
ГЛАВА 4. ДРУГИЕ ТОКСИНЫ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ
4.1. Мультифункциональный самопроцессирующийся цитотоксин RTX (MARTX)
4.1.1. Структурно-функциональные особенности MARTX
4.1.2. ПЦР-детекция генов rtxA, rtxC и последовательности, кодирующей актин-связывающий домен ACD-RtxA
4.2. Нейраминидаза и остров патогенности VPI-
4.3. Термолабильный гемолизин/цитолизин
4.4. Редко встречающиеся токсины
4.4.1. Термостабильный токсин
4.4.2. Шигаподобный токсин (веротоксин)
4.4.3. Термостабильный прямой гемолизин (TDH) и TDH-родственный гемолизин (TRH) V.parahaemolyticus
4.4.4. Определение генов «редких» токсинов с помощью ПЦР и дот-гибридизации
4.5. Токсины с неизвестными генетическими детерминантами
4.5.1. Новый холерный токсин (NCT)
4.5.2. Токсин W

та процессинга. Действительно, согласно данным Vector NTI, молекула рго-HlyA имеет заряд -15,26, а зрелый белок - -7,46.
Таким образом, рекомбинантный белок НА/Р обладал всеми типами описанной для него активности: гемагглютинирующей и протеолитической включая способность к процессингу СТ, LT и рго-HlyA. Штамм E.coli Jml03 рНР61 - продуцент НА/Р депонирован в ГКПБ «Микроб» под номером КМ 192 и защищен патентом на изобретение.
1.5. Доказательства идентичности НА/Р и NMDCY
1.5.1. Об открытии NMDCY
В 1996 г. группой индийских исследователей Saha Р.К. et al. был впервые описан новый цитотоксический фактор холерных вибрионов, обозначенный авторами как NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin). Вначале он был выявлен у трех ctx'zot асе sto'hlyA+-штаммов V.cholerae nonOl/non 0139 (серогрупп 05, 026 и нетипируемого), выделенных от больных с клиникой холероподобной диареи (Калькутта, 1989-1991). Очищенный препарат этого секретируемого токсина представлял собой термолабильный белок с ММ приблизительно 35 кДа, не имеющий генетического и иммунологического родства с СТ, LT, Н1уА и шигаподобными токсинами I и II, причем этот (один и тот же) белок вызывал накопление жидкости в петлях кишечника кроликов и округление клеток линий СНО, HeLa и Vero, т.е. обладал одновременно энтеротоксической и цитотоксической активностями.
В дальнейшем авторы сообщили о способности к продукции этого токсина штаммами других серогрупп V.cholerae non01/non0139, вызвавшими крайне тяжелые заболевания людей [Sharma С. et al., 1998], и о выделении NMDCY из клинического нехолерогенного штамма V.cholerae Ol Инаба (W05) [Mitra R. et al., 1998]. Его ММ составляла 35 кДа, а по иммунологическим и биологическим свойствам препарат был идентичен полученному ранее из штамма 026 серогруппы.
Генетические детерминанты NMDCY не были установлены, хотя авторы в одной из работ [Saha Р.К., Nair G.B., 1997] упоминали о проводимых