Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток

• Автор: Малкин, Геннадий Андреевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Хантавирусы

1.1 Общие сведения

1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов

1.3 Антигенные и генетические взаимоотношения

1.4 Специфическая лабораторная диагностика

1.5 Применение клеточных культур в хантавирусологии

ЧАСТЬ II СОБСТВЕННЫЕИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материалы и методы исследовании

2.1 Клеточные культуры
2.2 Вирусы
2.3 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела
2.4 Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА)
2.5 Методы иммуноферментного анализа (ИФА)
2.6 Метод индикации фокусобразующихсдиниц (МФОЕ)
2.7 Реакция нейтрализации в культуре клеток (PH)
2.8 Изоляция хантавирусных штаммов
2.9 Индикация микоплазм в культуре клеток методом ПЦР
2.10 Санация клеточных культур ПТ-1 и 4647 от микоплазменной контаминации
2.11 ОТ-ПЦР
2.12 Методы электронной микроскопии
2.13 Статистические методы
ГЛАВА 3. Репликация патогенных хантавирусов в клеточных линиях различного происхождения
3.1 Сравнительная оценка эффективности методов индикации размножения
3.2 Адаптация хантавирусов к размножению в клеточных культурах различного происхождения
3.3 Динамика размножения хантавирусов в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур
3.3.1 Определение оптимальной множественности заражения
3.3.2 Влияние различных условий на динамику накопления вируса Пуумала в КЖ _
3.3.3 Анализ динамики размножения вируса Пуумала в течение длительного периода времени в культуре клеток VERO
3.3.4 Характеристика ФОЕ патогенных хантавирусов в культурах VERO и Vero Еб
ГЛАВА 4. Изоляция и идентификация штаммов хантавирусов
4.1 Изолирование хантавирусов в культуре клеток
4.2 Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, PII)
ГЛАВА 5. Морфологическая характеристика хантавирусов
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ
АГ — антиген
АТ - антитела
БОЕ - бляшкообразующие единицы
БСА — бычий сывороточный альбумин
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ГЛПС-ДОБ - ГЛПС, вызванная вирусом Добрава/Белград
ГЛПС-ПУУ - ГЛПС, вызванная вирусом Пуумала
ДОБ - вирус Добрава/Белград
ДОБ/Куркино - генотип вируса ДОБ, хозяин - полевая мышь
ДОБ/Сочи - генотип вируса ДОБ, хозяин - кавказская лесная мышь
ИФА - иммуноферментный анализ
КЖ - культуральная жидкость
КЛ - клетки
лизат клеток - клетки, разрушенные замораживанием/оттаиванием
мАТ - моноклональные антитела
М3 - множественность заражения
МФА - метод флюоресцирующих антител
МФОЕ - метод индикации фокусобразующих единиц
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с образ ной транскрипцией
Г1УУ - вирус Пуумала
PH - реакция нейтрализации
СЕУ - вирус Сеул
ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин
ФИТЦ - флюоресцеин-5-изотиоцианат
ФОЕ - фокусобразующие единицы
ХПС - хантавирусный пульмональный синдром
ХГН - вирус Хантаан
ЭС - Энросепт
DMP-30 - 2,4,6 - три диметиламинометил фенол
PBS - фосфатный буферный раствор
VERO - культура Vero; в отличие от Vero Е6 выделено
прописными буквами для облегченного восприятия в тексте

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) занимает ведущее место среди природно-очаговых инфекций в России. Возбудители этой инфекции в составе рода Hantavirus входят в семейство Bunyaviridae.K настоящему времени доказана этиологическая роль четырех хантавирусов в структуре заболеваемости ГЛПС: в европейской части России и странах Европы - вирусы Пуумала (ПУУ) и 3 генотипа вируса Добрава/Белград (ДОБ); в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии - вирус Хантаан (ХТН) и его подтип Амур и вирус Сеул (СЕУ). Таким образом, под одним названием «ГЛПС» регистрируются, по крайней мере, четыре этиологически самостоятельных хантавирусных инфекций. Естественными хозяевами хантавирусов являются грызуны и насекомоядные, в организме которых вирус длительное время коэволюцинировал. Хантавирусы с трудом адаптируются к размножению в организме лабораторных животных, а также в клеточных культурах, что вероятно объясняет более чем тридцатилетний период безуспешных попыток изолировать возбудитель ГЛПС, вирусная природа которого уже была доказана [90]. Возможность использования клеточных культур для культивирования хантавирусов стала активно изучаться после успешной адаптации вируса Хантаан, изолированного на лабораторных мышах, к культуре клеток карциномы легких человека, А549 [31].

клеток Уего Е6 для выявления выжившего вируса. Через 6-7 суток выявляли образовавшиеся в культуре клеток ФОЕ. Титр вируснейтрализующих антител определяли по 80 % подавлению числа ФОЕ.
2.8 Изоляция хантавирусных штаммов
Для выделения хантавирусов использовали описанную ранее методику [86]. Материал для заражения брали от грызунов у которых по результатам предварительного исследования были выявлены антитела и/или хантавирусный антиген. В качестве инокулята для заражения культуры клеток использовали 10 % суспензию легочной ткани грызунов. Клетки Уего Е6, 4647 и ПТ-1 по достижении 80-90 % монослоя использовали для заражения вирусами. После заражения использовали среду роста (ИМЕМ) без добавления телячьей сыворотки. Через 12-14 дней культивирования при 37 °С заражённые клетки снимали со стекла смесью 0,02 % версена и 2,5 % трипсина в соотношении 1:1. 1/3 клеток использовали для дальнейшего пассирования; 1/3 клеток исследовали для индикации размножения вируса по выявлению хантавирусного антигена в МФА, оставшиеся клетки замораживали и хранили при - 70 °С до окончания процесса изоляции штамма. После 5-6 «слепых» пассажей в случае отрицательного результата пассажные материалы уничтожались. При обнаружении специфического антигена в клетках проводилось дальнейшее пассирование этих клеток до получения не менее 60 % зараженных клеток в поле зрения. Далее вирусным материалом, полученным замораживанием и оттаиванием антиген