Влияние структуры 5`-конца РНК на образование вирусных рибонуклеопротеидов с участием белка оболочки потексвирусов in vitro

• Автор: Петрова, Екатерина Кирилловна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Изучение образования вирионов вирусов растений
2. Роль клеточных факторов в упаковке генома вирусов растений со спиральной структурой
2.1. Модификации структурных вирусных белков клеточными ферментами при сборке вириона
2.2. Участие клеточных шаперонов в упаковке вирусного генома и сборке вириона
3. Функции белка оболочки у вирусов растений со спиральной структурой
2.1. Транспортная функция белка оболочки
3.2. Участие белка оболочки в векторном переносе вирусов
3.3. Другие функции вирусного белка оболочки
4. Образование вирусных и вирусоподобных частиц у потексвирусов in vitro .
4.1. Образование вирусных и вирусоподобных частиц у X вируса картофеля in vitro
4.2. Образование вирусных и вирусоподобных частиц у вируса мозаики папайи in vitro
4.3. Образование вирусных и вирусоподобных частицу других представителей группы потексвирусов
4.4. Изучение сигнала инициации сборки вирусных частиц
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Заражение растений X вирусом картофеля
2. Выделение препарата X вируса картофеля
3. Выделение препаратов других потексвирусов
4. Выделение препарата вируса мозаики костра
5. Выделение препарата вируса табачной мозаики

6. Выделение РНК из вирусных препаратов
7. Выделение белка оболочки X вируса картофеля
8. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле
9. Электрофоретический анализ РНК в денатурирующем полиакриламидном геле
10. Трансляция в бесклеточной белоксинтезирующей системе из лизата ретикулоцитов кролика
11. Получение вирусных рибонуклеопротеидов
12. Электронная микроскопия
13. Атомно-силовая микроскопия
14. Ферментативный гидролиз РНК РНКазой Н
15. Полимеразная цепная реакция
16. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
17. Рестрикция ДНК
18. Лигирование вектора и вставки
19. Трансформация бактериальных клеток
20. Выделение плазмидной ДНК
21. Конструирование плазмид - получение конструкций для транскрипции
22. Транскрипция in vitro
23. Кэпирование транскриптов in vitro
24. Обработка РНК кислой пирофосфатазой табака (ТАР)
25. Обработка РНК дрожжевой экзорибонуклеазой XRN-
26. Метод анализа траекторий наночастиц (Nanoparticle tracking analysis -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Объект исследования
2. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК

2.1. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК, с помощью просвечивающей электронной микроскопии
2.2. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК, с помощью атомносиловой микроскопии
2.3. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК, с помощью
трансляционного теста
3. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с компонентами генома ВМК и функционально активным фрагментом геномной РНК 3 ВМК
3.1. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с компонентами генома ВМК и функционально активным фрагментом геномной РНК 3 ВМК, с помощью просвечивающей электронной микроскопии
3.2. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при
инкубации БО ХВК с компонентами генома ВМК и функционально активным фрагментом геномной РНК 3 ВМК, с помощью атомно-силовой микроскопии^А
3.3. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с компонентами генома ВМК и функционально активным
фрагментом геномной РНК 3 ВМК, с помощью трансляционного теста
4. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с копированным функционально активным фрагментом геномной РНК 3 ВМК (ББ-фрагментом)
5. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с некэпированным и копированным 5'-концевым транскриптом РНК ХВК длиной 1320 нуклеотидов
5.1. Изучение вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с некэпированным и кэпированным 5'-концевым транскриптом РНК ХВК

появляется все больше свидетельств того, что вирусные БО вовлечены во взаимодействие с различными факторами клетки-хозяина.
Заражение фитовирусами индуцирует экспрессию хозяйских генов Hsp70, кодирующих клеточные шапероны. Белки теплового шока этого семейства взаимодействуют с вирусной репликазой потивирусов и являются компонентами вирусного репликационного комплекса (Hafren et al., 2010, Dufresne et al, 2008). В растениях, дефектных no Hsp70 вследствие умолкания генов, у АВК наблюдаются нарушения в репликации опосредованные БО (Hafren et al, 2010). J-домен белков CPIP, кошаперонов Hsp70, взаимодействует с БО потивирусов и играет важную роль при развитии потивирусной инфекции (Hafren et al, 2010, Hofius et al, 2007). Нарушения экспрессии БО потивирусов ингибирует экспрессию вирусных генов, однако CPIP в комплексе с Hsp70 способны нейтрализовать этот эффект (Hafren et al, 2010). Таким образом, Нзр70/СР1Р-зависимый механизм может предотвращать преждевременную сборку вирионов на ранних стадиях инфекции, позволяя идти эффективной репликации и трансляции вирусного генома.
Другой J-домен содержащий белок, названный NbDnaJ, связывается с БО ХВК в растениях N.benthamiana (Cho et al., 2012). Этот белок специфически распознаёт структуру РНК в виде шпильки «stem-loop 1» (SL1), расположенную в 5'-нетранслируемой области, которая также необходима для вирусной репликации и транспорта (Lough et al., 2006). Исследования на растениях, неспособных экспрессировать NbDnaJ вследствие умолкания генов, или, наоборот, в растениях, продуцирующих NbDnaJ в больших, чем обычно, количествах, показали, что NbDnaJ является негативным регулятором репликации и транспорта ХВК на ранних стадиях инфекции, который действует через взаимодействия с БО ХВК и SL1 участком РНК (Cho et al., 2012). J-домен содержащие кошапероны часто ассоциированы с репликацией фитовирусов, причём в некоторых случаях они привлекают вирусный БО для выполнения своих функций.