Фенотипические и генетические маркеры холодовой адаптации вируса краснухи

• Автор: Дмитриев, Григорий Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

Оглавление
Введение

1. Обзор литературы

1.1 Структурная и молекулярно-биологическая характеристика вируса

краснухи

1.1.1. Структура вириона вируса краснухи

1.1.2. Геном вируса краснухи

1.1.3. Репликация генома вируса краснухи и трансляция неструктурных белков

1.1.4. Генетичсская изменчивость вируса краснухи

1.2. Механизмы аттенуации вируса краснухи

1.2.1. Вакцинные штаммы вируса краснухи

1.2.2. Детерминанты аттенуации вируса краснухи
2. Материалы и методы
2.1. Вирусный материал
2.2. Клеточные линии
2.3. Реактивы
2.4. Тест на иммуногенность
2.5. Культуральные методы
2.5.1. Накопление вируса в культуре клеток
2.5.2. Титрование вируса краснухи по ЦПД в культуре клеток ЯК
2.5.3. Реакция нейтрализации
2.6. Молекулярно-биологические методы
2.6.1. Выделение вирусной РНК
2.6.2. Реакции обратной транскрипции
2.6.3. Полимеразная цепная реакция
2.6.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.6.5. Пробоподготовка ампликонов и секвенирование генома вируса краснухи
2.6.6. Филогенетический анализ и компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.6.7. Количественное определение вируса

2.7. Определение 1С антител к вирусу краснухи методом иммуноферментного анализа (ИФА)
2.8. Статистическая обработка результатов исследования
3. Результаты и обсуждение
3.1. Биологическая характеристика дикого и атгенуированного вариантов штамма С-77 ВК (ч и са)
3.1.1. Получение вирусного материала
3.1.2. Анализ температурной чувствительности штаммов вируса краснухи
3.1.3. Изучение и са вариантов штамма С-77 в иммунологическом маркерном тесте
3.2. Выявление генетических маркеров аттенуации штамма С-77 вируса краснухи
3.2.1. Подбор праймеров для секвенирования генома вируса краснухи и оптимизация условий проведения реакции ПЦР
3.2.2. Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности генома дикого и аттенуированного вариантов ВК (штамм С-77)
3.2.3. Выявление и анализ мутаций, потенциально ответственных за холодовую адаптацию штамма С-77 вируса краснухи
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литеразуры

Список сокращений
ак - аминокислота БОЕ - Бляшкообразующая единица ВСЖ - Вируссодержащая жидкость ВК - вирус краснухи
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ДИ РНК - дефектная интерферирующая РНК ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинулеозидтрифосфат
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
кДа - килодальтон
мРНК - матричная РНК
н. - нуклеотид
НСБ (ИБР) - неструктурные белки
НТО (1Дг) - нетранслируемая область
ОРС (ОКЕ) - открытая рамка считывания
ОТ (ЯТ) - обратная транскрипция
п. - пассаж
п.о. - пар оснований
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - ПЦР в режиме реального времени
П-Про - папаин-подобная протеиназа
РНК - рибонуклеиновая кислота
PH - реакция нейтрализации
PH - репликативный посредник
РФ — репликативная форма
СБ (БР) - структурные белки
СВК - синдром врожденной краснухи
ТГ - торможение гемагглютинации

Образование дефектных интерферирующих РНК
Особенностью репликации РНК, обнаруженной для большинства РНК-содержащих вирусов, является синтез делеционных мутантов, содержащих вместо генома дефектные интерферирующие (ДИ) РНК [35]. Оптимальными условиями для получения ДИ РНК является последовательный пассаж неразве-денного исходного материала вируса и персистирующая инфекция в культуре клеток. ДИ РНК мешает репликации геномной РНК, чем ослабляет цитопатогенность вируса. ДИ РНК сохраняют геномные последовательности, необходимые для репликации и капсидирования. При последовательном пассировании клонированного с помощью бляшек вируса краснухи ДИ РНК определялась после четвертого пассажа [18, 35]. Появлению ДИ РНК в последовательно пассируемых штаммах вируса краснухи сопутствовало резкое уменьшение количества геномной РНК в клетках, инфицированных этими штаммами, и уменьшение титра, что указывало на наличие интерференции. ДИ РНК также были обнаружены при длительном хроническом инфицировании культур клеток вирусом краснухи [35]. После инфицирования ДИ РНК не выявлялись до 19 дня, что указывало на отсутствие необходимости в ДИ РНК для инициации инфекции вирусом краснухи [18]. Это отличает ее от других вирусов с более выраженной литической способностью, для которых присутствие ДИ частиц необходимо для инициации хронической инфекции. После появления ДИ РНК в инфицированных клетках количество присутствующей геномной РНК постепенно уменьшается до недетектируемого уровня. Размер ДИ РНК вируса краснухи, определенный как при проведении последовательного пассирования, так и при хронической инфекции, варьировался от 1000 нуклеотидов до 7000-8000 нуклеотидов. Было показано, что крупные фрагменты ДИ РНК размером от 6700 до 7200 нуклеотидов, образующиеся при проведении последовательного пассирования вируса краснухи в клетках Уего, содержат открытую рамку считывания интактных неструктурных белков и крупную делецию в открытой рамке считывания структурных белков. Короткие ДИ РНК размером от 600 до 800 нуклео-