Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1

• Автор: Аканина, Дарья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список использованных сокращений
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Описание заболевания
2.2. Общая характеристика вируса гриппа
2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N
11ередача вируса
Клинические проявления
Патогенез
2.4. Способы диагностики вируса гриппа
2.4.3. Иммуноферментный анализ
2.4.4. Молекулярные методы
2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция
2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Методы
4. Результаты
4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР
4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР
4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы
4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы
4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы
4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени
4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР
4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N
4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики
4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP)

4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N
4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS
4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа
4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1
5. Обсуждение результатов
6. Выводы
7. Библиография
8. Приложения

Список использованных сокращений
ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ИФЛ - иммуноферментный анализ НА - гемагглютинин NA - нейраминидаза КЭ - куриные эмбрионы АГ - антиген
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота РСК - реакция связывания комплемента РТГА - реакция торможения гемагглютинации ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат
ОТ/ПЦР - полимеразная ценная реакция с предшествующей реакцией обратной транскрипции
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
кДНК - комплементарная дезиксирибонуклеиновая кислота
ЕФ - европейская фармакопея
ФСП - фармакопейная статья предприятия
СТО - стандарт организации
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭИД - эмбриональная инфекционная доза
п.н. - пара нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
мАТ - моноклональные антитела
ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ЯМР - ядерный магнитный резонанс ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
WHO - world health organization (всемирная организация здравоохранения)

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65° С. Время отжига составляет 15-30 сек.
3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит с З’-конца цепей в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Химическими компонентами для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дНТФ. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72° С. Время протекания синтеза - 15-40 сек., в зависимости от длины фрагмента (Ellis J.S., 2002).
При выявлении молекул РНК первой стадией реакции является обратная транскрипция (ОТ), т.е. превращение РНК в кДНК, с которой в дальнейшем будут амплифицироваться специфические фрагменты. Поэтому ПЦР для РНК-содержащих вирусов называется ОТ/ПЦР (рисунок 4.).
На рисунке 3 представлены компоненты, необходимые для проведения ПЦР на матрице РНК (например, вируса гриппа).
1. ДНК-матрица - ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент;
2. Праймеры - синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.
3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.