Характеристика начальных этапов инфекции, вызванной вариантами одного штамма вируса клещевого энцефалита, обладающими селективным преимуществом при размножении в разных системах

• Автор: Шевцова, Анастасия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика
1.1. Общая характеристика рода Flavivirus
1.2. Процессинг вирусного полииротаина
1.3. Структурные белки фпавивирусов
1.4. Неструктурные белки флавивирусов
1.5. Репликация РНК
1.6. Связь различных участков генома с вирулентностью
2. Патогенетические характеристики ВКЭ
2.1. Клиническая картина клещевого энцефалита
2.2. Патогенез клещевого энцефалита
2.3. Генотипы ВКЭ и их распространение
2.4. Связь генотипов с вирулентностью
3. Иммунный ответ при кдещевом энцефалите
3.1. Особенности формирования противовирусного иммунного ответа
3.2. Иммунный ответ при клещевом энцефалите
3.3. Факторы, определяющие течение заболевание при инфекции ВКЭ
3.4. Общие сведения об интерфероновой системе
4. Связь ГЕТЕРОГЕННОСТИ ВИРУСНОЙ ПОПУЛЯЦИИ с патогенетическими характеристиками вируса
4.1. Общие положения эволюции популяции РНК-вирусов
4.2. Изменение вирусной популяции при смене хозяина
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Используемые вирусы
2. Используемые культуры клеток млекопитающих
3. Лабораторные животные
4. Получение гипериммунной асцитной жидкости (И АЖ)
5. Титрование инфекционного вируса
6. Титрование ВКЭ на мышах
7. Клонирование вируса методом бляшек
8. Концентрирование ВКЭ из КЖ инфицированных клеток
9. Моделирование инфекции
10. Определение концентрации IFN-a, -в и IFN-r в сыворотках крови мышей
11. Получение IFN на культуре кулбток L-
12. Определение ifn-чувствительпости ВКЭ методом титрования
13. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
14. Методы работы с белками
14.1. Приготовление проб для изучения экспрессии вирусных белков
14.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
14.3. Вестерн-блот
15. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
15.1. Выделение РНК
15.2. Обратная транскрипция
15.3. Полимеразная цепная реакция
15.4. Полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени (RealTimePCR)
15.5. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле:
15.7. Определение нуклеотидной последовательности
15.8. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. ОЦЕНКА ВИРУЛЕНТНОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХ ВИРУСНЫХ ВАРИАНТОВ НА МЫШАХ
2. Определение полных нуклеотидных последовательностей геномов гевертантов 58 и 57 83 ■
3. Детальная характеристика начальных этапов инфекции
3.1. Динамика появления вируса в крови, селезенке и мозге инфицированных животных на ранних стадиях инфекции при заражении вариантами ВКЭ
3.2. Динамика индукции IFN на ранних этапах инфекции
4. Опыт по смешанной инфекции PEBEPTAHTA 58 И 57 НА МЫШАХ линии BALB/C
5. Изучение динамики размножения вариантов ВКЭ в различных культурах клеток
5.1. Характеристика репродукции выбранного набора вирусов в перевиваемых культурах клеток.

5.2. Изучение цикла репродукции вариантов ВКЭ в культуре клеток СПЭВ
5.3. Детальное изучение цикла репродукции вариантов штамма ЭК-328 в культуре первичных фибробластов, а также в перевиваемых культурах клеток мышиных фибробластов 1-929 и макрофагоподобных клеток Р
6. Пассирование штамма ЭК-328, варианта М и ревертанта 58 в перевиваемых культурах МАКРОФАГОПОДОБНЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ
6.1. Характеристика вирусов, полученных при пассировании вариантов штамма ЭК-328 на клетках Ь-
6.2. Оценка вирулентности вирусных вариантов после 15-го пассажа на клетках 1. -929.
6.3. Сравнение полных нуклеотидных последовательностей вариантов ВКЭ, адаптированных к клеткам мышиных фибробластов 1,-
6.4. Характеристика вирусов, полученных при пассировании вариантов штамма ЭК-328 на клетках Р
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
ак - аминокислота(ы);
АПК — антигенпрезентирующая клетка;
АТ - антитела;
б/п - беспородные (мыши);
БОЕ - бляшкообразующая единица;
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита;
ГАГ - гликозаминогликаны;
ГМ-КСФ - гранулоцит-моноцит-колониестимулирующий фактор;
ед.- единица(ы);
и/п - интраперитонсально;
и/ц - интрацеребрально;
ИД50 - доза вируса, вызывающая заболевание 50% животных;
ИЛ - интерлейкин;
ИФА- иммуноферментный анализ; кДНК - комплементарная ДНК;
КЖ - культуральная жидкость;
ЛД50 - доза вируса, вызывающая смерть 50% животных;
НК - натуральные киллеры; нт - нуклеотид (ы);
НТО - нетранслируемая область;
НТС - натальная телячья сыворотка;
ОБ - оптическая единица;
ОРС - открытая рамка считывания;
ОТ - обратная транскрипция;
ПААГ— полиакриламидный гель;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РИЭФ - ракетный иммуноэлектрофорез;
РФ - репликативная форма; с/к - субкутанно;
СПЖ - средняя продолжительность жизни;
СПЖЗ - средняя продолжительность жизни до заболевания;
СПЭВ - культура клеток почек эмбриона свиньи;
ФНО - фактор некроза опухоли;
ЦНС - центральная нервная система;
ЦПД - цитопатическое действие;
ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит(ы);
ЭПР - эндоплазматический ретикулум;
ADAR — аденозиндезаминаза (adenosine-dcammase);
АРОВЕС - apolipoprotein В mRNA-editmg enzyme-catalytic polypeptid-like,
ATF2/c-Jun - activating tianscription factor 2/c-Jun;
DAI/DLM-1/ZBP1 - DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors; eEF-la-эукариотический фактор элонгации (eukaiiotic elongation factor-la);
EGFP — модифицированный зеленый флуоресцентный белок (enchanced green fluorescence protein);
EMCV - вирус энцсфаломиокардита (encephalomyocarditis virus);
IFN - интерферон (interferon);
IgG - иммуноглобулин G (immunoglobulin G);
IRAK-4 - кипаза-4, ассоциированная с рецептором интерлейкина-1 (interleukin-1 receptor-associated kinase-4);
IRF — фактор регуляции интерферона (interferon-regulating factor);

поверхности различных АПК; участвует в- перзентации липидного антигена Т-клеткам). Активированные NKT клетки выполняют функции, приписанные как хелперным Т-клеткам, так и ЦТЛ - секреция цитокинов и высвобождение цитотоксических молекул (Godfrey et al., 2004).
6) уб Т-клетки несут на своей поверхности рецепторы, состоящие из у- и 6-цепи, уб Т-клетки составляют около 2% от всей популяции Т-лимфоцитов, однако в значительном количестве представлены в слизистой кишечника (Holtmeier et al., 2005)
Среди постоянно циркулирующих в лимфоидной ткани Т-клеток задерживаются только те, которые имеют соответствующие по специфичности антигенраспознающие рецепторы. Распознавшие антиген наивные CD4 Т-клетки (ThO) дифференцируются в эффекторы одного из двух классов - в хелперные CD4 ТЬ2-ютетки либо в CD4 Thl-клетки. Этот этап- развития адаптивного иммунитета имеет критическое значение, так как определяет характер самого ответа - будет ли в нем доминировать гуморальное звено в виде продукции. специфических АТ (участие Th2), или же процесс пойдет по линии активации ЦТЛ и макрофагов (участие Thl).
В опытах? in, vitro было показано, что CD4 Т-клетки, стимулированные в присутствии ИЛ-12 и у-ИФН, дифференцируются в CD4 Thl-клетки, ответственные за развитие клеточного иммунного ответа. Главными цитокинами, продуцируемыми этими клетками, являются у-ИФН, ФНО-а, ИЛ-2. При этом у-ИФН подавляет пролиферацию хелперных CD4 Тй2-клеток. Дифференцировку и активность Thl-ллмфоцитов ингибирует цитокин, синтезируемый Th2-лимфоцитами - ИЛ-10, а также ИЛ-4 и ИЛ-13, продуцируемые тучными клетками В условиях, когда наивные CD4 Т-клетки (ThO) получают костимулирующий сигнал от ИЛ-4 и ИЛ-13, развитие направляется в сторону CD4 1Ъ2-клеток, что приводит к проявлению гуморального иммунного ответа. Созревающие и зрелые ТЬ2-лимфоциты продуцируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-12 Секреция ИЛ-4 подавляет дифференцировку ThO-клеток в Т-клетки воспаления. Общими для Thl и ТЬ2-клеток являются ИЛ-3 и ГМ-КСФ. В условиях антивирусного ответа дифференцировка ThO-лимфоцитов в CD4 Thl-клетки или в хелперные CD4 ТШ-клетки не имеет абсолютного значения. В процессе развития инфекции под действием тех или иных цитокинов, а также в зависимости от строения и дозы антигена и генетических особенностей организма, может происходить переключение одного пути на другой (Хаитов и Пинегин, 2000; Biron and Sen, 2001).
Клоны В-клеток, специфичные к белковым атигенам, не могут вступить в ответную реакцию созревания и продукции АТ до тех пор, пока не произойдет их взаимодействие с соответствующими по специфичности зрелыми CD4 Т-кпетками. Встреча наивных В-