Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия

• Автор: Азаренок, Анастасия Александровна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 183 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Структура вируса гриппа
1.1 Г емагглютинин
1.2 Нейраминидаза
1.3 Мембранный белок М2
1.4 Мембранный белок М1
1.5 Нуклеопротеин
1.6 РНК-зависимая-РНК-полимераза
1.6.1 Белок PB 1
1.6.2 Белок РА
1.6.3 Белок РВ2
1.7 Неструктурные белки NS1 и NS2 (NEF)
1.7.1 Неструктурный белок NS1
1.7.2 Неструктурный белок NS2 (NEF)
Глава 2 Структурно-функциональные свойства эндотелия крове-
носных сосудов человека
2.1 Анатомо-физиологическая характеристика
2.2 Роль эндотелия в раннем воспалительном ответе
2.2.1 Адгезионные молекулы
2.2.2 Вазодилататоры
2.2.3 Вазоконстрикторы
2.2.4 Сосудистый эндотелий и система фибринолиза
Глава 3. Дисфункция эндотелия

3.1 Изменение секреторной активности эндотелия
3.2 Апоптоз эндотелиальных клеток
3.3 Взаимосвязь процессов апоптоза, гемостаза и воспаления
3.4 Вирусные инфекции и эндотелий
3.4.1 ДНК-содержащие вирусы
3.4.2 РНК-содержащие вирусы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1 Вирусы
1.2 Клеточные культуры
1.2.1 Культура эндотелиальных клеток человека линии

1.2.2 Культура клеток МБСК
1.3 Методы оценки репродукции вируса гриппа типа А
1.3.1 Определение инфекционной активности вируса гриппа
1.3.2 Полимеразная цепная реакция
1.3.3 Электронная микроскопия
1.4 Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала
1.5 Выделение поверхностные белков исследуемых вирусов
гриппа типа А
1.6 Оценка метаболизма эндотелиальных клеток линии
ЕАЬу926 с помощью МТТ-теста
1.7 Определение активности каспазы-3 иммуноцитохимиче-
ским методом
1.8 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии
ЕАЬу926
1.9 Выявление раннеапоптотических эндотелиальных клеток
линии ЕА1ту926
1.10 Определение активности тканевого активатора плазмино- ^

1.10.1 Определение активности тканевого активатора плаз-
миногена в эндотелиальных клетках линии EAhy
1.10.2 Определение активности тканевого активатора плаз-
миногена in vivo
1.11 Компьютерный поиск сходных аминокислотных последовательностей в белках человека и вирусе гриппа
1.12 Статистическая обработка полученных данных РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 1. Репродукция вируса гриппа типа А в эндотелиальных клетках
1.1 Инфекционная активность исследуемых штаммов вируса гриппа в культуре клеток EAhy
1.2 Выявление РНК, исследуемых штаммов вируса, в культуре клеток EAhy926 с помощью ПЦР
1.3 Выявление вирусных частиц исследуемых штаммов вируса, в культуре клеток EAhy926 электронномикроскопическим методом
1.4 Иммуногистоцитохимическое исследование аутопсийно-го материала от больных, умерших в эпидемию гриппа 2009-2010 гг.

1.4.1 Иммуногистохимический анализ аутопсийного мате-
риала легких
1.4.2 Иммуногистохимический анализ аутопсийного мате-
риала мозга
1.4.3 Иммуногистохимический анализ аутопсийного мате-
риала сердца
Глава 2. 2.

Дисфункция клеток эндотелия при воздействии исследуемых вирусов гриппа и их поверхностных белков
Электронно-микроскопический анализ морфологии клеточной культуры эндотелия, инфицированной вирусом гриппа
Изменение метаболизма эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 при воздействии исследуемых штаммов вируса гриппа типа А и его поверхностных белков

1. Отщепление кэп- фрагментов от хозяйских мРНК, которые используются в качестве праймеров для вирусной транскрипции [76; 141].
2. Взаимодействует с митохондриальными белками. Это взаимодействие блокирует экспрессию IFN-P, тем самым подавляя противовирусный иммунный ответ клетки-хозяина [141].
Белок РВ2 представляет собой последовательность из 759 аминокислотных остатков в которой выделяют следующие функциональные области, которые расположены достаточно симметрично. У N- конца и у С-конца молекулы белка РВ2 находятся домены, отвечающие за связь с белком РВ1 - последовательность аминокислотных остатков с 1 по 124 и с 577 по 759, соответственно. Домены отвечающие за связь с белком NP, так же находятся у двух концов молекулы РВ2 -последовательности аминокислотных остатков с 1 по 269 и с 580 по 683 [76].
В структуре белка РВ2 имеются также две последовательности аминокислотных остатков, которые участвуют в связывании хозяйских кэп-фрагментов мРНК. Одна последовательность находится на N-конце молекулы РВ2 (242-282 ак), вторая — на С-конце (538-577 ак) [76; 141]. Показано, что эти последовательности содержат значительное количество триптофановых остатков, которые важны для взаимодействия с кэп-структурой. Для транспорта из цитоплазмы в ядро имеются сигналы ядерной локализации, которые представлены последовательностями аминокислотных остатков с 449 по 495 и с 736 по 739 [76; 195].
Хотя большее количество белка РВ2 в инфицированных клетках локализуется в ядре, где образует комплекс с РВ1 и РА, РВ2 белок был также обнаружен в митохондриях [88]. Предполагалось, что РВ2 может способствовать сохранению функций митохондрий во время гриппозной инфекции [88]. В настоящее время показано, что РВ2 с помощью сигнала митохондриальной локализации (1-120 ак) взаимодействует с митохондриальным противовирусным сигнальным белком MAVS (также называемый VISA) [263; 319] и подавляет опосредованную этим белком экспрессию IFN-[3. Белки РВ2 вируса гриппа различаются по способности взаимодействовать с митохондриями. Локализация РВ2 в митохондриях характерно только для вирусов гриппа человека. Показано, что разница в митохондри-