Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина B из Pseudomonas syringae

• Автор: Метелев, Михаил Васильевич
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Цели и задачи исследования
Научная новизна и практическая значимость работы
Публикации и апробация работы
Структура и объем работы
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Общая характеристика ТОММ
Линейные азол(ин)-содержащие пептиды
Микроцин В
Стрептолизин
Ллантазолицин
Гоадспорин
Цианобактины
Тиопептиды
Боттромицины
Перспективы изучения ТОММ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оборудование
Расходные материалы
Реактивы и ферменты
Буферные растворы

Микробиологические среды
Бактериальные штаммы
Метод ПЦР
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Лигирование продукта амплификации в плазмидные вектора
Рестрикция
Выделение плазмидной ДНК (минипреп)
Секвенирование
Переосаждение ДНК спиртом
Приготовление компетентных клеток E. coli
Трансформация замороженных компетентных клеток E. coli
Процедура получения штамма XL1 Blue с делецией в геноме
Процедура молекулярного клонирования оперонов
Очистка ДНК-гиразы
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Опыт по расщеплению ДНК ДНК-гиразой in vitro
Получение релаксированной ДНК для определения активности ДНК-гиразы in vitro:
Выделение микроцина из клеток E. coli и ВЭЖХ-анализ
Масс-спектрометрический анализ (МАЛДИ и тандемная MC)
Определение антибактериальной активности антибиотиков и демонстрация SOS ответа внутри клеток
Тестирование токсичности Рр-МсВ, производящегося в клетках
Выделение РНК
Обратная транскрипция

ПЦР в реальном времени
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
Идентификация mcb оперонов Я. syringae
Исследование продукции вещества, подобного микроцину В, штаммом Я. syringae pv. glycinea В
Гетерологическая продукция Я. syringae микроцина В в клетках E. coli
Я5-МсВ1 и Ps-McBZ ингибируют рост клеток E. coli и действуют на ДНК-гиразу..
Видоспецифичность действия Яз-МсВ и Ес-МсВ
Исследование продукции вещества, подобного микроцину В, закодированного в тсЬ опероне Pseudomonas putida КТ2
Биологическая активность Яр-МсВ
Идентификация гомологичных оперонов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ПРОЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

гомологичного БМИ-зависимым дегидрогеназам ЛАП, продукт которого бы мог бы осуществлять дегидрирование тиазолинового цикла. Возможно, реакция катализируется цитохром Р450-зависимым белком Втг!. Анализ мутантов с делециями по генам btmFEJ не привел к успеху, поскольку продукция вещества полностью исчезала. Было отмечено, что образование гетероцикла может быть сопряжено с отрезанием С-концевой лидерной последовательности. Поскольку пептид-предшественник боттромицина синтезируется на рибосомах, его первой аминокислотой является метионин. В процессе созревания боттромицина остаток метионина отрезается: предполагается, что отрезание происходит либо под действием клеточной протеазы, либо специализированной протеазой, кодируемой в опероне. На роль белков, ответственных за отрезание первого метионина и С-концевой лидерной последовательности претендуют протеазы В1:тМ, В1:тН и Е^т! [95-98].
Кроме белков, участвующих в процессинге боттромицина, в биосинтетическом кластере закодированы гены предположительного транскрипционного фактора ЕИт!.. Делеция гена ЬГт! не влияет на продукцию боттромицина. Ген ЫтА кодирует трансмембранный белок, который, по-видимому, является транспортером боттромицина. Было показано, что при увеличении уровня экспрессии данного гена, уровень продукции боттромицина возрастает в 20 раз, что указывает на то, что уровень продукции может быть ограничен накоплением внутриклеточного боттромицина и интоксикацией клетки-продуцента. На рисунке 11Б приведена одна из предположительных схем последовательности реакций происходящих в процессе созревания [95].
Перспективы изучения ТОММ
В последнее десятилетие развитие технологий автоматического секвенирования ДНК
привело к осознанию исследователями огромного разнообразия рибосомально
синтезируемых низкомолекулярных биологически активных веществ. Новые и уже
известные РПП были объединены в отдельные классы на основании сходного устройства
кластеров генов биосинтеза РПП [2, 15, 16, 101-104]. Анализ постоянно увеличивающейся
базы данных геномных последовательностей позволяет предсказывать новые РПП,
существование которых затем подтверждается экспериментально. Последовательность