Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов

• Автор: Леонов, Вячеслав Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 190 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Принцип действия вакцины для иммунотерапии заболеваний,

ассоциированных с ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов

1.2. Белки Е7 - их структура и функции

1.3. Белок НБР-70 - структура и функции

1.4. Примеры получения фьюза Е7-Н8Р-

1.5. Производство рекомбинантных белков в Я. сегеп^/ае в промышленных

условиях

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Разработка процесса культивирования штаммов - продуцентов гибридных рекомбинантных белков Е7(11)-НБР70, Е7(6)-Н5Р70 и Е7(16)-ШР70, Е7(18)-НБР
2.2.1.1. Описание штаммов-продуцентов
2.2.1.2. Обоснование общей стратегии процесса культивирования на
основании проведенного анализа
2.2.1.3. Оценка ростовых свойств и продуктивности штаммов-продуцентов
2.2.1.4. Выбор модельного штамма для проведения исследований
2.2.1.5. Разработка этапа накопления биомассы
2.2.1.6. Этап экспрессии целевого белка
2.2.1.6.1. Питательная среда и условия культивирования этапа экспрессии целевого белка
2.2.1.6.2. Выбор оптимального способа индукции и углеродсодержащего субстрата
2.2.1.6.3. Анализ протестированных способов индукции
2.2.1.6.4. Оптимизация этапа биосинтеза путем математического моделирования
2.2.1.6.5. Апробация двухстадийной подпитки на штаммах-продуцентах 8СЯ-Е7( 18)-ШР70 и 8СЛ-Е7(11)-ШР70, 8СЯ-Е7(6)-Н8Р
2.2.2. Разработка способа дезинтеграции
2.2.2.1. Выбор состава лизирующего буфера
2.2.2.2. Влияние температуры на стабильность целевого продукта
2.2.2.3. Выбор соотношения лизирующий буфер - биомасса
2.2.2.4. Влияние давления и количества циклов дезинтеграции
2.2.3. Очистка субстанции гибридных рекомбинантных белков
2.2.4. Технологическая схема производства терапевтических вакцин..
2.2.5. Предвалидация технологического процесса
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ .
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Вирус папилломы человека (ВПЧ) - это семейство ДНК вирусов, включающее в себя около 200 типов вирусов, которые обладают заметным тропизмом по отношению к тканям эпителия [145]. Несмотря на сходное строение генома, разные типы ВПЧ поражают эпителий на различных областях тела. Около 40 типов ВПЧ инфицируют аногенитальную область и слизистую оболочку полости рта. ВПЧ является наиболее распространенным вирусом, передаваемым половым путем. Например, в США каждый год им заражаются 6,2 миллиона человек [211]. Основываясь на клиническом прогнозе развития заболевания, типы ВПЧ делят на «ВПЧ низкого риска» и «ВПЧ высокого риска» [152].
«ВПЧ низкого риска» или неонкогенные, к которым относятся типы 6 и 11, могут вызвать доброкачественные или малоопасные аномалии шейки матки, доброкачественную эпителиальную гиперплазию (возникновение аногенитальных кондилом, папиллом) и заболевание дыхательных путей - рекуррентный респираторный папилломатоз (РРП) [130].
«ВПЧ высокого риска» или онкогенные, к которым относятся типы 16 и 18, могут привести к неоплазии аногенитальной области, в том числе раку шейки матки, вульвы, влагалища, пениса и ануса, а также некоторым видам рака ротоглотки [95, 159, 209]. Среди последствий инфекции ВПЧ, ассоциированных с онкологическими заболеваниями, самым серьезным является рак шейки матки. В 2008 году в мире было зафиксировано более чем 500 000 случаев заболевания и 275 000 смертей, вызванных раком шейки матки [82, 159]. В Российской Федерации заболеваемость раком шейки матки находится на высоком уровне - 14 случаев на 100 000 взрослого женского населения (для сравнения в США этот показатель составляет 9 случаев на 100 000). Ежегодно в России впервые выявляется около 12-13 тысяч случаев заболевания раком шейки матки; 8 тысяч женщин умирает от этого заболевания. При этом аналогичный показатель смертности в США составляет только 3,5 тыс. женщин в год при сопоставимом

С другой стороны, существует зависимость между удельной скоростью роста культуры дрожжей и их склонностью к спиртовому брожению. В 1969 году X. Каспар Вон Мейнбург провел исследования роста культур дрожжей в условиях непрерывного культивирования, варьируя скорость разбавления (которая в условия непрерывного культивирования равна удельной скорости роста) от 0 до 0,45 ч'1. Он показал, что рост & сегетшае в непрерывной культуре при скорости разбавления в диапазоне 0,0-0,24 ч'1 отличается чисто дыхательным
метаболизмом (ЯС) = 1,0), а при увеличении скорости разбавления от 0,24 до 0,45 ч'1 катаболизм глюкозы идет по типу брожения [123].
Продукция этанола почти всегда сопровождается выделением других метаболитов, в том числе слабых органических кислот [168]. Поскольку дрожжи обычно культивируют при кислых значениях pH, слабые органические кислоты, проходя через плазматическую мембрану, ослабляют трансмембранный градиент pH [43, 203]. Для того, чтобы поддерживать внутриклеточный pH почти нейтральным, протоны должны выводиться из клетки комплексом АТФаз плазматической мембраны. АТФ, необходимое для осуществления этого процесса, обеспечивается диссимиляцией глюкозы, тем самым, снижая выход биомассы и рекомбинантного белка [203].
Энергия поддержания. С появлением методов непрерывного культивирования микроорганизмов, стало ясно, что экономический коэффициент Ухе при росте в условиях лимитированной подачи субстрата не является постоянной величиной и зависит от удельной скорости роста //.
В соответствии с концепцией энергии поддержания [163, 188], часть метаболической энергии, образующейся при катаболизме, не используется непосредственно для формирования биомассы. Вместо этого, эта, так называемая энергия поддержания, используется для различных процессов, не связанных с ростом, таких как поддержание pH, гомеостаза, кругооборот макромолекул.
В наиболее часто используемой модели для описания физиологии энергии поддержания, предполагается, что коэффициент энергии поддержания не зависит