Конструирование и клонирование искусственных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт

• Автор: Иматдинов, Ильназ Рамисович
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Вольгинский
• Количество страниц: 169 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1Л Актуальность темы

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цель и задачи исследований

1.4 Научная новизна результатов исследований

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы

1.8 Публикации

1.9 Структура и объем диссертации
1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые 13 на защиту
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Лихорадка долины Рифт: общая характеристика болезни
2.1.1 История изучения болезни
2.1.2 Распространение, экономический ущерб
2.1.3 Патогенез лихорадки долины Рифт
2.2 Таксономия и молекулярная биология вируса
2.2.1 Семейство Випуауігібае
2.2.2 Строение вириона
2.3 Репродукция вируса
2.3.1 Прикрепление и проникновение вируса
2.3.2 Слияние мембран
2.3.3 Транскрипция и репликация
2.3.4 Сборка и выход вирионов
2.4 Лабораторная диагностика
2.5 Вакцинопрофилактика
2.5.1 Живые вакцины

2.5.2 Инактивированные вакцины
2.5.3 Рекомбинантные вакцины
2.5.4 Вакцины на основе альфавирусных репликонов
2.5.5 Вирусоподобные частицы
2.5.6 ДНК-вакцины
2.6 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы и методы
3.1.1 Вирус
3.1.2 Штаммы микроорганизмов и плазмидные векторы
3.1.3 Культуры клеток
3.1.4 Питательные среды и антибиотики
3.1.5 Животные
3.1.6 Сыворотки и антигены
3.1.7 Реактивы и растворы
3.1.8 Лабораторное оборудование
3.1.9 Выращивание перевиваемых линий клеток
3.1.10 Культивирование вируса ЛДР 5
3.1.11 Определение инфекционной активности вируса
3.1.12 Определение вируснейтрализующих антител к вирусу ЛДР
3.1.13 Программное обеспечение
3.1.14 Подбор праймеров
3.1.15 Выделение нуклеиновых кислот
3.1.16 Синтез кДНК
3.1.17 Постановка полимеразной цепной реакции
3.1.18 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
3.1.19 Выделение нуклеиновых кислот из агарозного геля и их 63 очистка
3.1.20 Рестрикция ДНК

3.1.21 Обработка фрагментом Кленова
3.1.22 Лигирование фрагментов ДНК
3.1.23 Клонирование ДНК фрагментов
3.1.24 Трансформация клеток E. coli
3.1.25 Трансфекция плазмидной ДНК
3.1.26 Выделение плазмидной ДНК
3.1.27 Микрокапсулирование плазмидной ДНК
3.1.28 Секвенирование
3.1.29 Индукция экспрессии
3.1.3 0 Определение концентрации белка
3.1.31 Иммуноферментный анализ (ИФА)
3.1.32 Иммуноблоттинг
3.1.33 Статистическая обработка полученных результатов
3.2 Результаты и обсуждение собственных исследований
3.2.1 Конструирование библиотеки полноразмерных генов, 68 кодирующих иммунодоминантные белки Gn, Gc и N вируса лихорадки долины Рифт
3.2.1.1 Культивирование вируса ЛДР
3.2.1.2 Разработка ПЦР-системы для амплификации 71 полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки Gn, Gc и N
3.2.1.3 Расчет праймеров
3.2.1.4 Оптимизация условий ПЦР
3.2.1.5 Клонирование ампликонов генов в плазмидном векторе
3.2.2 Филогенетическая характеристика вируса ЛДР штамма «1974- 77 ВНИИВВиМ»
3.2.3 Клонирование полноразмерных генов, кодирующих 81 гликопротеины Gn и Gc в составе плазмидных векторов для экспрессии в эукариотических системах

Поверхность зрелого вириона ЛДР представлена симметричной икосаэдрической решеткой (Т = 12) [240, 260], которая образована 122 капсомерами, состоящими, в среднем, из 720 Си-вс гетеродимеров [21, 68,240].
2.4 Лабораторная диагностика
Недавние вспышки за пределами традиционной эндемичной зоны ЛДР и увеличение объемов международной торговли, привели к потребности в безопасных и высокоэффективных диагностических препаратах [92,208,220].
Возбудитель ЛДР относится к болезням вызывающим вирусные геморрагические лихорадки, которые рассматриваются в качестве потенциальных агентов биологического оружия [111, 176]. Схожесть клинических проявлений с другими геморрагическими лихорадками затрудняет постановку точного диагноза, тем самым, окончательный диагноз зависит от лабораторных результатов [81, 214, 238]. В виду того, что ЛДР относится к особо опасным инфекциям, проведение комплексных диагностических мероприятий накладывает ряд требований на лаборатории, ограничивая тем самым количество диагностических центров [185, 211].
Диагностика ЛДР может проводиться с применением различных методов, в том числе выделение вируса с помощью перевиваемых культур клеток или чувствительных животных [214], выявление антигена [57, 206], выявление генома в ПЦР [65, 88] и обнаружение вирусспецифических антител в серологических реакциях [214, 246], в том числе с применением рекомбинантного нуклеопротеина N [158, 200]. При остром течении в стадии лихорадки вирус ЛДР возможно выделить из сыворотки или цельной крови, а также из печени, селезенки, головного мозга или абортированного плода. Тем не менее, выделение вируса является длительной и дорогостоящей процедурой.
В связи с тем, что в первые дни болезни антитела к вирусу ЛДР не выявляются, а виремия может достигать высоких значений, выявление антигена методом ИФА и генома в ПЦР являются важными инструментами для ранней диагностики ЛДР.