Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана

• Автор: Кирьянова, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фукоиданы растительного сырья: структура и свойства

1.2 Фукозидазы: классификация, продуценты

1.2.1 Продуценты а-Ь-фукозидазы

1.2.2 Факторы, влияющие на биосинтез а-Ь-фукозидазы при культивировании продуцентов

1.3 Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов

1.3.1 Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК

1.3.2 Клонирование и экспрессия гена а-Ь-фукозидазы

1.4 Получение препаратов а-Ь-фукозидаз и их характеристика

1.4.1 Выделение и очистка а-Ь-фукозидаз
1.4.2 Физико-химические свойства а-Ь-фукозидаз различного происхождения
1.4.3 Продукты деструкции фукоидана
1.4.3.1 Функциональные свойства фукозы и
фукоолигосахаридов
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Объект исследования и условия культивирования
2.2 Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе
2.3 Методы молекулярного клонирования в бактериях
2.3.1 Выделение хромосомной ДНКЬ. гкатпозиъ 12Ь
2.3.2 Выделение плазмиды рЕТ-23Ь (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. соїі
2.3.3 Полимеразная цепная реакция

2.3.4 Создание генетических конструкций
«клонирующий вектор — встроенная ДНК»
2.3.5 Трансформация клеток химическим методом
2.3.6 Электрофорез в агарозном геле и визуализация ДНК
2.3.7 Выделение ДІЖ из агарозного геля
2.4 Определение активности a-L-фукозидазы
2.5 Очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы
2.6 Получение спиртоосажденного ферментного препарата
2.7 Определение физико-химических свойств фермента
2.8 Выделение фукоидана из биомассы бурых водорослей
2.9 Определение степени гидролиза фукоидана
2.10 Исследование пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов
2.11 Общие биохимические и микробиологические методы исследования
2.12 Статистическая обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 3 КОНСТРУИРОВАНИЕ
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО
ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА a-L-ФУКОЗИДАЗЫ
3.1 Сравнительное исследование a-L-фукозидаз
различного происхождения
3.2 Выбор объекта клонирования и системы экспрессии
3.3 Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора рЕТ-23Ь (+)
3.4 Исследование стабильности генетически модифицированного
штамма E. coli top
ГЛАВА 4 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ a-L-ФУКОЗИДАЗЫ И
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА
4.1 Подбор оптимальных условий глубинного культивирования генетически модифицированного штамма Е. coli top

4.1.1 Очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы
4.2 Получение спиртоосажденного ферментного препарата a-L-фукозидазы
4.3 Технология получения ферментного препарата рекомбинантной
a-L-фукозидазы E. coli top
4.4. Исследование влияния pH и температуры на активность
a-L-фукозидазы
ГЛАВА 5 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ФУКОИДАНА РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ФУКОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ
5.1 Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза фукоидана и идентификация продуктов гидролиза
5.2 Изучение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов
5.3 Расчет себестоимости рекомбинантной a-L-фукозидазы
по предлагаемой технологии
5.4 Технико-экономический расчет производства фукозы и
фукозосодержащих гидролизатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ

сахаров на раннем этапе синтеза иммуноглобулинов способствует их конформационным изменениям [30].
Функциональные свойства фукоолигосахаридов практически не изучены. Исследование способности фукозосодержащих продуктов стимулировать рост бифидобактерий представляет большой практический интерес не только для создания новых пребиотиков, но и для получения комплексных препаратов иммуностимулирующего и пребиотического действия [12, 23] .
В научной и медико-биологической литературе встречаются множество направлений использования фукозы в будущем, например:
возможно, фукоза ингибирует развитие лейкемии и рака молочной железы;
- свободную и связанную фукозу надо использовать при диабете, поскольку наблюдается измененный метаболизм фукозы у пациентов;
может быть рекомендована для питания больных кистозным фиброзом и защите таких пациентов от вторичных инфекций;
для поддержания усилий организма при защите от общих вирусных и бактериальных инфекций[118, 124].