Молекулярные основы биотехнологии бактериальных магнитных частиц

• Автор: Груздев, Денис Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. МАГНИТОТАКСИС И МАГНИТОТАКТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ

1Л . Морфология и филогенетическое разнообразие магнитотактических бактерий

ГЛАВА 2. МАГНЕТОСОМЫ

2Л Разнообразие и характеристика кристаллов магнетосом

2.2. Мембрана магнетосом

2.3 Белки мембраны магнетосом

ГЛАВА 3. БИОМИНЕРАЛИЗАЦИЯ МАГНЕТОСОМ
3.1 Геномная организация магнетосомальных генов
3.2. Биосинтез магнетосом
ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНИЕ МАГНЕТОСОМ
ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
5.2 Культивирование бактерий
5.3 Выделение и очистка магнетосом
5.4 Выделение ДНК
5.5 Выделение высокомолекулярной ДНК
5.6. Получение генетических конструкций методом ПЦР
5.7. Детектирование продуктов ПЦР
5.8. Очистка ПЦР-фрагментов
5.9. Рестрикция ДНК
5.10. Лигирование ДНК
5.11 Фосфорилирование ДНК
5.12 Выделение плазмидной ДНК
5.13. Секвенирование ДНК
5.14 Приготовление химически компетентных клеток
5.15. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
5.16. Экспрессия белка методом автоиндукции
5.17 Анализ суммарного белка клеток E. coli BL21(DE3)
5.18 Вестерн-блот анализ
5.19. Фракционирование растворимых клеточных белков E. coli
5.20. Очистка гибридных белков
5.21. Иммуноферментный анализ
5.22. Определение IgG-связывающей способности модифицированных магнетосом
5.23. Оптимизация интеграции гибридных белков в мембрану магнетосом
5.24. Световая и просвечивающая электронная микроскопия
5.25. Атомно-силовая микроскопия
5.26. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей
5.27. Секвенирование и аннотирование генома Magnetospirillum sp. SO-
5.28. Реконструкция магнетосомального геномного острова Magnetospirillum ьр. 80-1
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. ОПИСАНИЕ ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЙ
6.1. Морфологические и физиологические особенности магнитотактической бактерии Magnetospirillum ер
6.2. Секвенирование и анализ генома Magnetospirillum яр
6.3. Сборка и аннотирование магнетосомального геномного острова Magnetospirillum эр
6.4. Сравнительный анализ магнетосомальных геномных островов представителей рода Magnetospirillum
ГЛАВА 7. ПОЛУЧЕНИЕ МАГНЕТОСОМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ НА ПОВЕРХНОСТИ АНТИТЕЛАМИ
7.1. Получения магнетосом с целостной мембраной
7.2. Проектирование и сборка генетических конструкций
7.2.1. Получение генетической конструкции тЪ
7.2.2. Получение генетической конструкции тЬЪ
7.2.3. Получение генетической конструкции /игг
7.2.4. Получение генетической конструкции /ий/йй
7.3. Получение гибридных иммуноглобулинсвязывающих белков
7.3.1. Экспрессия рЕТ23а(+)/тЬ, рЕТ23а(+)/тЬЬ, рЕТ23а(+)/т22 и рЕТ23а(+)/гшз1:ЬЬ
7.3.2. Фракционирование белков
7.3.3. Очистка гибридных белков
7.4. Исследование функциональной активности модифицированных белков
7.5. Встраивание гибридных белков в мембрану магнетосом

ИаОН, pH среды доводили до 6.75. Клетки культивировали в микроаэрофильных условиях в 15 л ферментере в течение 3-4 дней при 28°.
5.3 Выделение и очистка магнетосом
При достижении стационарной фазы роста клетки Magnetospirillum ер. 80-1 центрифугировали при 10 ООО g в течение 10 минут при +4 °С. Осажденные клетки ресуспендировали в 20 мМ ПЕРЕ Б буфере с рН=7.4, содержащим, во избежание разрушения белков мембраны магнетосом клеточными протеазами, 4 мМ ЭДТА и 0.1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для более эффективного разрушения бактериальных клеток, проводили двукратную процедуру замораживания-оттаивания полученной суспензии. Окончательное разрушение клеток проводили при помощи ультразвукового дезинтегратора (ЗопориН, ВапбеНп, Германия) в течение 10 минут. С целью избавления от клеточных остатков суспензию центрифугировали на низких оборотах в течение 2 мин. Магнетосомы отделяли от клеточных остатков на магнитном стенде (Ргоп^а, США) и промывали 10-15 раз 20 мМ НЕРЕБ-буфером с рН=7.4, содержащим 200 мМ 1ЧаС1. После чего магнетосомы центрифугировали в 55% растворе сахарозы в течение 4 ч при 100 000 g при 4 °С. Очищенные магнетосомы многократно промывали НЕРЕ8 буфером с нейтральным pH и хранили при 4°С. Чистоту препарата и целостность мембраны контролировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. Критерием сохранности мембраны магнетосом служило отсутствие агрегатов. Для определения веса препарата магнетосом, часть очищенных магнетосом сушили при 105°С и взвешивали на аналитических весах.