Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis

• Автор: Сибирный, Владимир Андреевич
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 279 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
1. ВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ИТЕРАТУРЫ
2.1. Этанол, метанол и формальдегид
2.2. Микробная деградация формальдегида и метанола
в сточных водах
2.3. Химические и физико-химические методы определения этанола, метанола и формальдегида
2.4. Хемосенсорные методы анализа этанола, метанола и формальдегида
2.5. Методы анализа этанола, метанола и формальдегида
с использованием ферментов
2.5.1. Характеристика метилотрофных дрожжей и метилотрофного метаболизма
2.5.2. Свойства алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей
2.5.3. Выделение и очистка алкогольоксидазы (АО) из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
2.5.4. Биосенсорные методы анализа этанола, метанола и формальдегида
2.6. Конструирование штаммов дрожжей с увеличенной продукцией этанола
2.6.1. Конструирование продуцентов этанола на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae
2.6.2. Конструирование продуцентов этанола на основе бактерий
Zymomonas mob Hi и Escherichia coli
2.6.3. Биотехнологическое совершенствование нетрадиционных
дрожжей Pichia stipitis
2.6.4. Конструирование продуцентов этанола на основе метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha
2.6.5. Промышленная продукция этанола из лигноцеллюлозы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЗЛ. Объекты исследований
3.2. Условия культивирования
3.3. Определение биомассы клеток
3.4. Пермеабилизация клеток
3.5. Получение бесклеточного экстракта (БЭ)
3.6. Определение содержания белка
3.7. Определение активности ферментов
3.7Л. Определение активности оксидаз
3.7.2. Определение активности алкогольдегидрогеназы (АДГ)
3.7.3. Определение активности формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ)
3.7.4. Определение активности пероксидазы (ПО)
3.7.5. Единицы определения активности ферментов, формула расчетов
3.8. Электрофорез АО Н. ро1утогрИа
3.9. Определение константы Михаэлиса (Км) алкогольоксидазы
Н. ро1утогр1га для метанола, этанола и формальдегида при помощи кислородного электрода Кларка
3.10. Определение формальдегида и метанола в промышленных стоках с использованием АО и 4-амино-5-гидразино-3-меркапто-1,2,4-триазола (АГМТ)
3.10.1. Определение содержаня формальдегида
3.10.2. Определение содержания метанола
3.11. Одновременное определение содержания метанола и формальдегида с использованием АО и гидразона З-метил-2-бензотиазолинона (МБТГ)
3.12. Анализ содержания этанола
3.12.1. Анализ содержания этанола с использованием
алкогольдегидрогеназы (АдГ)

3.12.2. Анализ содержания этанола с алкогольоксидазой и пероксидазой (метод АОП)
3.12.3. Анализ содержания этанола оксидазно-химическим методом
с использованием АО и МБТГ
3.12.4. Определение содержания этанола в соках и плодово-ягодных
винах
3.13. Биосенсорные методы анализа этанола
3.13.1. Разработка амперометрического биосенсора на основе алкогольоксидазы
3.13.2. Формирование чувствительной мембраны
3.13.3. Формирование амперометрического АОП- биоосенсора
3.! 3.4. Формирование двухслойного двухферментного элемента
биосенсора
3.14. Ферментативное определение формальдегида
3.14.1. Определение формальдегида методом АОП
3.14.2. Определение содержания формальдегида в рыбе
3.15. Использование электрохимического биосенсора для определения метанола в промышленных сточных водах
3.16. Выделение из мутантов дрожжей Натепи1а ро1утогрка АО с пониженным сродством к субстратам
3.16.1. Штаммы и среды
3.16.2. Определение аминокислотных последовательностей
3.16.3. Молекулярно-биологические методы
3.16.4. Определение операционной стабильности биосенсоров
3.17. Выделение и биотехнологическое использование формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ)
3.17.1. Источник ФАДГ, условия культивирования и получения бесклеточного экстракта (БЭ)
3.17.2. Выделение и очистка ФАДГ

формальдегида является реакция с хромотроповой кислотой [265]. Метод позволяет определять формальдегид в пределах концентраций 0,05 - 1,0 мг/дм3 при использовании для дистилляции 200 мл пробы [247]. Определение формальдегида состоит в его нагревании с хромотроповой кислотой в очень кислой среде. В таких условиях образуется растворимое красно-фиолетовое соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству альдегидов [266]. Метод достаточно специфичен для формальдегида, позволяет определять формальдегид в диапазоне концентраций 0,05 - 1,0 мг/7^ [247], однако, некоторые вещества (глюкоза) также дают слабую положительную реакцию. Определению формальдегида в сточных водах этим методом препятствуют также фенолы, ионы некоторых металлов и окислители, которые должны быть удалены путем специальной обработки. Предложены чувствительные методы определения формальдегида с использованием 2-гидразинбензотиазола (НВТ) и его производного -тетрафторбората 2-гидразинобензотиазол-М-нитробензолдиаэония
(НВТ-ИЧВП) и гидразон З-метил-2-бензотиазолинона (МБТГ) [266], но недостатком таких методов является восприимчивость к помехам со стороны 20 веществ, в том числе аммиака, ионов кальция, железа, марганца, ртути, цинка, нитратов, фенолов, фосфатов и др. Описан чувствительный и достаточно селективный метод определения формальдегида с использованием 4-амино-3-гидразино-5-меркапто-1,2,4-триазола (АГМТ) [48]. Формальдегид и другие альдегиды образуют с этим соединением продукты различной окраски, которые можно избирательно определять спектрофотометрически. Пороговая чувствительность метода - 1,5 нмолей формальдегида в 1 мл пробы.
В таблице 1.1 представлены свойства часто используемых спектрофотометрических методов определения формальдегида. Наиболее чувствительны методы с использованием МВТГ, АГМТ и кислоты „Гепй-]”.