Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды

• Автор: Анохина, Татьяна Орестовна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 146 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Г лава 1. Бактерии рода Pseudomonas, стимулирующие рост растений
1.1 Механизмы положительного влияния ризосферных псевдомонад на растения
1.2 Феназиновые антибиотики ризосферных псевдомонад
1.2.1 Общая характеристика фсназиновых антибиотиков
1.2.2 Биосинтез феназиновых антибиотиков
Глава 2. Деградация полициклических ароматических углеводородов
2.1 Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов
2.2 Деградация полициклических ароматических углеводородов растениями
2.2.1 Поглощение полициклических ароматических углеводородов растениями
2.2.2 Влияние ароматических углеводородов па структурную организацию клетки
2.2.3 Пути превращения полициклических ароматических углеводородов в растительной клетке
2.3 Деградация полициклических ароматических углеводородов бактериями рода Pseudomonas
2.3.1 Бактериальное окисление нафталина
2.3.2 Биохимические пути окисления фенантрена
2.3.3 Гены катаболизма полициклических ароматических углеводородов у бактерий рода Pseudomonas
Глава 3. Использование бактерий-деструкторов и растений для биоремедиации почв
3.1 Биологические способы очистки почв
3.2 Взаимодействие растений и микроорганизмов на загрязненных почвах
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Материалы и методы
4.1 Микробиологические методы
4.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе
4.1.2 Питательные среды и условия роста
4.1.3 Выделение ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ
4.1.4 Определение способности роста бактерий на различных ПАУ
4.1.5 Определение антагонистической активности ризосферных штаммов
4.1.6 Конъюгационный перенос плазмид
4.1.7 Элиминация плазмид

4.1.8 Стабильность плазмид биодеградации
4.2 Биохимические методы
4.2.1 Определение активностей ферментов биодеградации нафталина
4.2.2 Определение содержания ПАУ и продуктов их деградации
4.2.3 Определение уровня продукции индолил-3-уксусной кислоты
4.2.4 Идентификация антибиотически активных соединений
4.2.5 Определение масс-спектров метаболитов штамма P. jluorescens 38а
4.3 Методы работы с ДНК
4.3.1 Выделение плазмидной ДНК
4.3.2 Выделение хромосомной ДНК
4.3.3 Электрофорез в агарозном геле
4.3.4 Визуализация плазмидной ДНК по методу Экхардта
4.3.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
4.3.6 Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
4.3.7 Трансформация клеток Pseudomonas плазмидной ДНК (электропорация)
4.4 Методы работы с растениями
4.4.1 Стерилизация семян и бактеризация семян/проростков
4.4.2 Микровегетациоиный эксперимент в стерильных условиях
4.4.3 Микровегетационный эксперимент в нестерильных условиях
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 5. Скрининг ризосферных штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов на наличие генов, вовлеченных в биосинтез антибиотиков различных групп
5.1 Амплификация генов, необходимых для продукции антибиотиков
5.1.1 Амплификация гена phlD, вовлеченного в биосинтез ароматического антибиотика 2,4-диацетилфлороглюцина
5.1.2 Амплификация гена ргпС, вовлеченного в биосинтез антибиотика пирролиитрина
5.1.3 Амплификация гена pltB, вовлеченного в биосинтез антибиотика пиолютеорина
5.1.4 Амплификация фрагмента phzCD, вовлеченного в биосинтез гетероциклического антибиотика феназин-1-карбоновой кислоты
5.2 Биохимический анализ продуцируемых антибиотиков
Глава 6. Выделение ризосферных бактерий-деструкторов полициклических ароматических углеводородов
6.1 Определение субстратной специфичности ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ
6.2 Определение локализации nah генов у ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ
6.3 Определение фитостимулирующих свойств у ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ
6.4 Тестирование ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ на видовую принадлежность
6.5 Определение ростовых характеристик ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ
6.6 Определение удельной активности ключевых ферментов деградации нафталина у ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ
Глава 7. Взаимодействие ризосферных плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas с растениями
7.1 Ростовые характеристики PGPR Pseudomonas и стабильность плазмид биодеградации нафталина
7.2 Рестрикционный анализ плазмиды pBS216
7.3 Удельная активность ключевых ферментов катаболизма нафталина у плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas
7.4 Влияние плазмид на взаимодействие PGPR Pseudomonas и растений
7.5 Деградация нафталина плазмидосодержащими PGPR Pseudomonas
Глава 8. Деградация фенантрена ризосфсрными штаммами в микровегетационном эксперименте
Глава 9. Ризосферные штаммы PGPR Pseudomonas, способные к деградации ПАУ в присутствии тяжелых металлов
9.1 Получение полифункциональных штаммов PGPR Pseudomonas
9.2 Характеристика полифункциональных штаммов
9.3 Влияние никеля на жизнеспособность вариантов штамма P. chlororaphis PCL1391
9.4 Влияние никеля на активность ферментов деградации нафталина в вариантах штамма P. chlororaphis PCL1391
9.5 Биодеградация нафталина
Глава 10. Обсуждение результатов П
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

NahAaAbAcAd

OH NAD(P)H
1,2-дигидроксинафталин
. NahC I NahD

транс-о-гидроксибензаль-пировинофадная кислота
j NahE

салициловый альдегид | NahF

COOH салициловая кислота | NahG

OH катехол GatA . v NahH

1-гидрокси-2-нафтойная кислота
I Phdl
r^/COOH

транс- 2'-карбоксибензаль-пировиногрэдная кислота
j PhdJ COOH

2-карбоксибензальдегид

COOH о-фталевая кислота

HO. ^COOH

протокатеховая кислота
2 . ..
орто- расщепление мета-расщепление
орто-расщепление мета-расщепление
Рис. 2.3. Биохимические пути деградации нафталина и фенантрена (Kiyohara and Nagao, 1978).
NahAaAbAcAd - нафталин диоксигеназа, NahB - сй-нафталин дигидродиол дегидрогеназа, NahC - 1,2-дигидроксинафталин диоксигеназа, NahD — 2-гидроксихромен-2-карбоксилат изомераза, NahE — /ирдне-о-гидроксибснзилиденпируват гидратаза-альдолаза, NahF - салицилальдегид дегидрогеназа, NahG - салицилат гидроксилаза, NahH - катехол-2,3-диоксигеназа, CatA - катехол-1,2-диоксигеназа; Phdl - 1-гидрокси-2-нафтоат диоксигеназа, PhdJ — 2'-карбокси-бензальпируват гидротаза-альдолаза, PhdK — 2-карбоксибензальдегид дегидрогеназа; 1 - 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаза,
2 - протокатехат-3,4-диоксигеназа, 3 - протокатехат-4,5-диоксигеназа.