Структурно-функциональное исследование природных пептидных антибиотиков

• Автор: Овчинникова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06, 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 78 с. : ил.; 19х14 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.
Стремительный рост числа патогенов, резистентных к антибиотикам, диктует насущную необходимость создания новых противоинфекционных лекарственных средств. В ряде случаев традиционные антибиотики уже не обеспечивают эффективного контроля над возбудителем при развитии хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний. Возрастающая
антибиотикорезистентность наблюдается в отношении ряда штаммов Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium и Pseudomonas aeroginosa, а также таких распространенных патогенов человека, как Staphylococcus aureus и Staphylococcus pneumoniae. Структурно-функциональное изучение природных пептидных антибиотиков показывает, что на их основе возможно создание новых антимикробных средств.
Эффективные механизмы защиты от патогенов вырабатывались многоклеточными организмами в процессе их эволюции. Лимфоцитарный иммунитет возник лишь с появлением челюстных рыб и существует менее чем у 2% видов многоклеточных организмов. Однако даже те из них, которые обладают способностью вырабатывать антитела, в первые часы встречи с патогеном могут полагаться только на защитные механизмы системы врожденного иммунитета. Эндогенные антимикробные пептиды (далее АМП) относятся к молекулярным факторам системы врожденного иммунитета, обеспечивающим выживание организмов в окружении патогенов (бактерий, грибков, простейших, вирусов). Распространенность АМП в природе и их структурное разнообразие дают основание полагать, что каждый биологический вид вырабатывает свой уникальный набор защитных пептидов, позволяющий ему успешно бороться с окружающей его патогенной микрофлорой. В настоящее время определены структуры около тысячи АМП, выделенных из различных тканей человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растений, грибов и бактерий. Природные пептидные антибиотики обладают способностью инактивировать широкий спектр микроорганизмов. Поиск и исследование новых АМП позволяет лучше понять закономерности функционирования врожденного иммунитета у человека. По мере углубления наших знаний о пептидных антибиотиках появляется все больше сведений об их участии в процессах регуляции иммунитета и регенерации тканей.
Наряду с фундаментальными исследованиями структурно-функциональных свойств АМП важное прикладное значение имеют работы по созданию эффективных лекарственных средств на их основе. Природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Подавляющее большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам, поэтому развитие резистентности патогенов к ним менее вероятно из-за низкоизбирательного механизма их действия и возможно только при существенных изменениях структуры и свойств клеточной мембраны. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков.

Известно, что длительная терапия антибиотиками в ряде случаев вызывает состояние иммунодефицита и эндотоксемию, однако многие АМП наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью. Все это создаёт предпосылки для создания новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков, лишенных перечисленных выше недостатков. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных АМП, многие зарубежные фармацевтические компании уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе, а первые из них уже проходят клинические испытания. Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической науки, а разработка способов их получения с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.
Диссертация выполнялась по разделам основных направлений научных исследований ИБХ РАН «Структура и функции белков и пептидов” и „Биотехнология”, утвержденных Ученым Советом ИБХ РАН. Работа проводилась при поддержке РФФИ; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы; ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»; ФЦП «Национальная технологическая база» на 2007-2011 годы; целевой программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».
Цель и задачи исследования.
Цель данной диссертационной работы состоит в исследовании структуры, биологических свойств и молекулярных механизмов действия природных пептидных антибиотиков, а также в разработке биотехнологических способов их получения. Объектами исследования являются антимикробные пептиды ареницины из целомоцитов морского червя Arenicola marina [тип — кольчатые черви (Annelida), класс - многощетинковые (Polychaeta)]; аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurélia aurita [тип - кишечнополостные (Cnidaria), класс - сцифоидные (Scyphozoa)]; буфорин из желудка азиатской жабы Bufo bufo gargarizans [тип — хордовые (Chordata), класс - земноводные (Amphibia), отряд - земноводные бесхвостые (Anura), семейство - жабы настоящие (Bufonidae)]; дефенсин и липид-траспортирующий белок из чечевицы обыкновенной Lens culinaris [отдел - покрытосеменные (Magnoliophyta), класс - двудольные (Dicotylédones), порядок - бобовоцветные (Fabales), семейство -бобовые (Fabaceae), подсемейство — мотыльковые (Faboideae)]; зервамицин и антиамебин из мицелиальных спорообразующих грибов Emericellopsis salmocynnemata и Emericellopsis minima [отдел - настоящие грибы (Eumycota), подотдел - аскомицеты (Ascomycotina), класс - эуаскомицеты (Euascomycetes)]; латероцидин и латероцин из аэробной грамположительной бактерии Brevibacillus laterosporus; лихеницидин из терморезистентной грамположительной бактерии Bacillus licheniformis.

4.2. Создание генно-инженерной конструкции для экспрессии рекомбинантного дефенсина из семян чечевицы Lens culinaris.
Создана генно-инженерная конструкция, позволяющая проводить препаративную экспрессию дефенсина Lc-Def из семян чечевицы Lens culinaris в клетках Е. coli. В состав плазмидного вектора pE-Txx-Lc-Def для экспрессии гибридного белка, содержащего дефенсин чечевицы, были включены следующие регуляторные элементы: промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, lac-оператор, консенсусный сайт связывания бактериальной рибосомы и стартовый кодон ATG. Открытая рамка считывания завершается стоп-кодоном ТАА, а транскрибируемая область ограничивается терминатором транскрипции фага Т7. Для подавления базальной экспрессии гена гибридного белка в состав вектора pE-Trx-Lc-Def был включен ген lac-penpeccopa (lacl). В состав вектора также входят сайт инициации репликации (Ori) плазмиды pBR322 и маркерный ген р-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой клеток Escherichia coli к ампициллину (до 500 мкг/мл) и позволяющий проводить отбор клеток, содержащих векторную ДНК, путем выращивания на соответствующей селективной питательной среде. Размер плазмиды составил 5903 п.н., размер кодируемого гибридного белка - 172 аминокислотных остатка (19,0 кДа). Конструкция pE-Trx-Lc-Def предназначена для функционирования в штаммах Е. coli, способных синтезировать РНК-полимеразу фага Т7. Белок-носитель тиоредоксин А широко применяется для суперэкспрессии биологически активных полипептидов, в первую очередь для экспрессии полипептидов, обогащенных остатками цистеина. Расщепление гибридного белка бромцианом по остатку Met, введенному между последовательностями белка-носителя и дефенсина, позволяет получать рекомбинантный дефенсин, идентичный природному. Для предотвращения фрагментации белка-носителя при обработке бромцианом внутренние остатки Met были заменены методом направленного мутагенеза. В целях упрощения очистки целевого продукта в состав гибридного белка Trx-Lc-Def была включена N-концевая последовательность из восьми остатков гистидина, позволяющая проводить очистку гибридного полипептида методом металло-хелатной аффинной хроматографии.
Конструирование плазмидного вектора pE-Trx-Lc-Def осуществлялось путем лигирования BglII/XhoI-фрагмента плазмиды pET-31b(+) (Novagen), содержащего область инициации репликации, Т7 терминатор, гены р-лактамазы и lac-penpeccopa, со вставкой, кодирующей ген гибридного белка. Искусственный ген, содержащий промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, lac-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид (последовательно связанные гистидиновый октамер, тиоредоксин с заменой M37L, сайт расщепления бромцианом и дефенсин), был получен путем синтеза набора олигонуклеотидов с последующей сборкой и амплификацией промежуточных и конечного продуктов методом ПЦР. Выбор структуры олигонуклеотидов для синтеза каждого из структурных элементов основывался на их нуклеотидных последовательностях, депонированных в банках данных GenBank, EMBL-Bank, DDBJ.