Использование фаговых мини-антител для иммуноанализа диагностически-значимых антигенов

• Автор: Фомин, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения об иммунной системе; биосинтез поликлональных антител

1.2. Получение мини-антител с использованием технологии фагового дисплея

1.3. Иммунохимические методы в биотехнологической и

микробиологической практике

Глава 2. Собственные исследования

2.1. Объекты, материалы и методы исследований

2.1.1. Объекты исследования

2.1.2. Выделение ферритина из печени крупного рогатого скота

2.1.3. Процедура аффинной селекции мини-антител
2.1.4. Дот-иммуноанализ
2.1.5.Выделение перитонеальных клеток
2.1.6. Микроскопические методы
2.1.7. Фармакодинамические методы
2.1.8. Хроматографический анализ
2.1.9. Получение наночастиц золота и их конъюгатов с антителами
2.2. Результаты исследований и их обсуждение
2.2.1. Применение антител для детекции ферритина
2.2.1.1. Получение мини-антител на ферритин и их использование в дот-анализе
2.2.1.2. Получение поликлональных антител на ферритин и исследование уровня выработки интерлейкинов в процессе иммунизации
2.2.1.3. Конструирование сэндвич-метод ИФА для обнаружения ферритина в сыворотке крови крупного рогатого скота
2.2.1.3.1. Протокол прямого ИФА ферритина при помощи поликлональных антител
2.2.1.3.2. Протокол прямого ИФА ферритина при помощи фаговых антител
2.2.1.3.3. Исследования чувствительности и специфичности поликлональных и фаговых антител на ферритин
2.2.1.3.4. Протокол выявления ферритина с помощью фаговых и поликлональных антител сэндвич-методом
2.2.2. Использование мини-антител для определения биодинамических ,
параметров различных лекарственных форм диминазена
2.2.3. Применение мини-антител для детекции возбудителя туберкулеза животных
2.2.4. Получение мини-антител к поверхностным антигенам АгояртЦит
ЬгаяЦете 8р245 и их использование для детекции микробных клеток
Заключение
Выводы
Список сокращений и условных обозначений Список литературы

Введение
Актуальность темы. Успехи современной медицины, ветеринарии и фитопатологии зачастую зависят от того, удается ли детектировать специфические антигены в организме животных или человека, в растениях, почве, воде или других объектах окружающей среды. В частности, профилактику и лечение многих инфекционных заболеваний существенно облегчает точное и быстрое обнаружение вызвавших их патогенных микроорганизмов. Для диагностики многих заболеваний необходимо сначала вырастить культуру потенциального патогенного микроорганизма и проанализировать спектр его физиологобиохимических особенностей. Хотя классические микробиологические тесты проверены временем и обладают достаточно высокой специфичностью, они весьма трудоемки и дорогостоящи. Кроме того, имеются сложности идентификации тех патогенных микробов, которые неактивно растут в культуре или совсем не поддаются культивированию. Чтобы устранить эти принципиальные ограничения был разработан (наряду с методиками молекулярной диагностики) широкий спектр иммунохимических методов [5, 122, 149].
К иммунохимическим относятся методы, основанные на взаимодействии растворимых или корпускулярных антигенов (Аг) со специфическими антителами (Ат). Как сами методы, так и их приложения в клинической лабораторной практике чрезвычайно разнообразны [35].
Степень разработанности проблемы. Современная иммунохимия предлагает широкий ассортимент качественных и количественных методов анализа Аг, отличающихся по чувствительности и степени сложности [13, 113, 132].
В частности, весьма привлекательным маркером для иммунохимического анализа представляются золотые наночастицы (ЗНЧ). В качестве метки в мембранных тестах (дот- и блот-анализы) широко применяют радиоактивные изотопы (1251, |4С, 3Н) и ферменты
(пероксидазу, щелочную фосфатазу и др.). В 1984 г. вышли четыре независимых работы [57, 102, 135, 177], в которых в качестве метки для твердофазного иммуноанализа было предложено использовать ЗНЧ. Применение конъюгатов коллоидного золота (КЗ) в методе дот-блот анализа основано на том, что насыщенная красная окраска «золотого» маркера делает возможным визуально отслеживать результаты взаимодействия Аг-Ат на твердом носителе. Иммунозолотые методы в дот-анализе превосходят прочие (в частности, ИФА) по чувствительности [73], простоте, быстродействии и дешевизне. Чувствительность метода можно увеличить с помощью реакции усиления солями серебра [129] или золота (автометаллография) [78], что, несомненно, расширяет границы применения метода. Оптимизированный вариант твердофазного анализа с использованием денситометрической системы Quantity One (Bio-Rad) обеспечивает линейный диапазон детектирования от 1 пМ до 1 мкМ [147] с пределом детекции 100 аМ, который был снижен до рекордных 100 зМ с применением усиления солями серебра. Применение современных инструментальных методов детекции, таких как фототермическое отклонение лазерного зондирующего луча, которое вызвается нагревом локального окружения поглощающих частиц за счет импульсов нагревающего лазера (LISNA [54]), также обеспечивает очень широкий диапазон детекции в пределах 3 порядков вплоть до нескольких отдельных частиц в пятне дота.
При специфическом окрашивании подложку с нанесенным исследуемым антиегнным материалом инкубируют в растворе Ат (реже других биоспецифических зондов), меченных ЗНЧ [7]. В качестве зондов