Трансгликозилирование природных и модифицированных нуклеозидов термостабильными нуклеозидфосфорилазами Geobacillus Stearothermophilus

• Автор: Таран, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. НУКЛЕОЗИДЫ И НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1 Природные и модифицированные нуклеозиды

1.2 Нуклеозидфосфорилазы. Структура и механизмы катализа

1.2.1 Общие характеристики и особенности нуклеозидфосфорилаз

1.2.2 Бактериальные пуриинуклеозидфосфорилазы

1.2.3 Пиримидинспецифичные нуклеозидфосфорилазы

1.2.4 Тимидинфосфорилаза и пиримидиннуклеозидфосфорилаза

1.3 Биотехнология нуклеозидов

1.3.1 Использование нуклеозидфосфорилаз в синтезе модифицированных нуклеозидов
1.3.2 Ферментативное трансгликозилирование нуклеозидов
1.3.3 Технологические подходы в биосинтезе нуклеозидов
1.4 Заключение
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы и ферменты
2.1.2 Олигодезоксирибонуклеотиды
2.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.4 Лабораторное оборудование
2.1.5 Буферы и растворы
2.2 Методы
2.2.1 Приготовление компетентных клеток и трансформация
2.2.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.3 Выделение и очистка хромосомной ДНК С.з1еаго1кегторЫ1ш
2.2.4 Амплификация фрагментов генов с хромосомной ДНК G.stearothermophilus
2.2.5 Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля

2.2.6 Молекулярное клонирование
2-2.7 Электрофоретическое разделение белков
2.2.8 Экспрессия нуклеозидфосфорилаз G. stearothermophilus
2.2.9 Выделение нуклеозидфосфорилаз G. stearothermophilus
2.2.10 Определение концентрации белка
2.2.11 Иммобилизация нуклеозидфосфорилаз G. stearothermophilus
2.2.12 Синтез природных и модифицированных нуклеозидов
2.2.13 Спектрофотометрическое определение активности нуклеозидфосфорилаз
ГЛАВА 3. ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ И
МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫМИ
НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗАМИ
GEOBA С ILL US STEARO THERMOPHIL US
3-1 Клонирование генов, экспрессия и выделение пуриннуклеозидфосфорилазы II и
пиримидиннуклеозидфосфоралазы G. stearothermophilus В-2
3-2 Иммобилизация рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus В-2194, исследование их свойств и использование в реакциях фосфоролиза и трансгликозилирования природных и модифицированных нуклеозидов
3-3 Синтез модифицированных нуклеозидов медицинского
назначения. Синтез 2-хлор — 2 ’-дезоксиаденозина (Кладрибина) ферментативным трансгликозилированием с использованием препаратов термостабилъных нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus ВКМ-2
3.3.1 Оптимальная схема синтеза 2-хлор-2‘-дезоксиаденозина
3.3.2 Выбор источника модифицированного основания
3.3.3 Подбор оптимальных количеств донора дезоксирибозо-1-фосфата и проведение синтеза 2-хлор-2 ’-дезоксиаденозина
3.3.4 Выделение и очистка 2-хлор-2 ’-дезоксиаденозина
3.3.5 Анализ и сертификация целевого 2-хлор-2 ’-дезоксиаденозина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ade - аденин Ado - аденозин
AraU- l-ß-D-арабинофуранозилурацил
ATP - аденозинтрифосфат
BSA - бычий сывороточный альбумин
2CldAdo - 2-хлор-2'-дезоксиаденозин (Кладрибин)
2ClAde - 2-хлораденин
2ClAdo - 2-хлораденозин
2FAde - 2-фтораденин
2FAdo - 2-фтораденозин
dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты
dThd - тимидин
DTT - дитиотреитол
FaraA - 2-фтораденин-9-р-0-арабинофуранозид (Флударабин) АгаА - 9-р-В-арабинофуранозиладенин, dAdo - 2’-дезоксиаденозин,
Tran - тимин,
dGuo - 2’-дезоксигуанозин,
dRibP - дезоксирибозо-1-фосфат
Gua - гуанин
Guo - гуанозин
Hyp - гипоксантан
Ino - инозин
IPTG - изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид
SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)
TEMED - тетраметилэтилеидиамин Ura - урацил Urd-уридин AA - акриламид
бис-АА - -метилен-бисакриламид
НФ - нуклеозидфосфорилазы
ПААТ - полиакриламидный гель
PyNP - пиримидиннуклеозидфосфорилаза
PuNP - пуриннуклеозидфосфорилаза II
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТСА- 1,2,4-триазол-З-карбоксамид
Трис - трис-(оксиметил)аминометан
ТФ, ТР - тимидипфосфорилаза
УФ, UP - уридинфосфорилаза
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ИФП - иммобилизованный ферментный препарат

структуры, так и аминокислотной последовательности TP E. coli и PyNP В. stearothermophilus позволяет экстраполировать полученные для PyNP данные и на ТР. Фермент ТР состоит из двух идентичных субъединиц с суммарной молекулярной массой 90 кДа (Avraham Y., et al. 1990; Desgranges C., et al. 1981). Сравнение всех известных на сегодняшний день последовательностей генов ТР показывает, что все ферменты являются гомологами (последовательности ТР E. coli и человека идентичны на 39%).
Кинетические исследования ТР E. coli показали, что связывание субстратов в ферменте происходит последовательно. Первым из субстратов с ферментом связывается фосфат, а последним из продуктов реакции покидает активный центр дезоксирибозо-1-фосфат (Schwartz М., 1971). Эти данные подтверждаются результатами стабилизации фермента фосфатом или дезоксирибозо-1-фосфатом, но не тимином или тимидином (Krenitsky Т.A., 1981). Сходные результаты были получены для ТР из других источников (Avraham Y., et al. 1990; Iltzsch M.H., et al.1985).
Особенностью TP является ее специфичность в отношении 2'-дезоксирибозы. В то же время, ТР менее специфична по отношению к пятой позиции пиримидинового кольца. В организмах, имеющих только один фермент, способный расщеплять пиримидиновые нуклеозиды (PyNP), этот фермент с успехом может использовать как рибозу, так и 2'-дезоксирибозу (Hamamoto Т., et al. 1996). ТР представляет собой гомодимер S-образной формы. Каждая субъединица димера состоит из двух доменов: a/ß -домена и отделенного от него щелью меньшего a-домена, которые соединены тремя петлевыми областями (рис. 11). Мономер состоит из 440 аминокислот. Вторичная структура мономера включает в себя 17 a-спиралей (НІ-Ш7) и два ß-листа (А и В) (рис. 12). ß-лист А является смешанным листом, состоящим из б цепочек (ß-ІА - ß-6A), ß-лист В состоит из четырех антипараллельных цепочек ß-ІВ - ß-4B). а-Домен (аминокислотные остатки 1-65 и 163-193) включает шесть a-спиралей и сайт связывания тимидина. a/ß-Домен (остатки