Идентификация гена вакуолярного Na+/H+-антипортера ячменя и перспективы его использования для повышения солеустойчивости культурных растений

• Автор: Васекина, Анастасия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Солевой стресс и солеустойчивость растений

1.1.1. Определение солеустойчивости

1.1.2. Воздействие солевого стресса на растение

1.1.3. Клеточные детерминанты солеустойчивости

1.2. Механизмы солеустойчивости растений

1.2.1. Поступление Na+ в корень

1.2.2. Отток Na+ из клеток корня

1.2.3. Радиальный транспорт в корне
1.2.4. Транспорт ионов Na+ в ксилему и отток из ксилемы
1.2.5. Рециркуляция Na+ из листьев по флоэме
1.2.6. Внутриклеточная компартментация ионов Na+
1.2.7. Адаптация к соли при помощи анатомических образований или неравномерного распределения ионов в клетках разных типов
1.2.8. Усиленная аккумуляция совместимых осмолитов
1.2.9. Сигналы трансдукции солевого стресса в растениях
1.2.10. Восприятие сигнала повышенной концентрации Na+ во внешней среде.
SOS-путь передачи сигналов
1.2.11. АБК-зависимые цепи передачи стрессовых сигналов
1.2.12. Регуляция экспрессии генов
1.3.14а+/Н+-антипортеры - важная детерминанта солеустойчивости растений
1.3.1. Сравнительная характеристика№+/Н+-антипортеров из различных организмов.
1.3.2. Филогенетический анализ
1.3.3. Семейство SOS-Like плазмалеммарных NaVH'-антипортеров растений
1.3.4. Семейство NHX внутриклеточных Ыа+/Н+-антипортеров растений
1.3.4.1. Внутриклеточная локализация
1.3.4.2. Биохимические свойства
1.3.4.3. Структура
1.3.4.4. Особенности экспрессии
1.3.4.5. Регуляция активности
1.3.4.6. Функции

1.4. Цели и задачи работы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Получение растительного материала
2.3. Выделение РНК
2.4. Синтез первой цепи кДНК
2.5. ПЦР
2.5.1. Определение нуклеотидной последовательности кДНК гена вакуолярного Па+/Н+-антипортера ячменя (HvNHX2)
2.5.2. Исследование экспрессии HvNHX2 в корнях, стеблях и листьях взрослых растений ячменя
2.6. Клонирование ПЦР-продуктов методом TA-cloning
2.7. Выделение плазмидной ДНК
2.8. ОТ-ПЦР в реальном времени
2.9. Получение поликлональных антител к HvNHX
2.9.1. Выбор фрагмента антигена (HvNHX2), конструирование праймеров, ПЦР
2.9.2. Наращивание рекомбинантного белка
2.9.3. Определение растворимости рекомбинантного белка
2.9.4. Препаративное выделение рекомбинатного белка и его очистка на целлюлозе
2.10. Выделение плазматических мембран из растений ячменя
2.11. Выделение вакуолярных мембран из растений ячменя
2.12. Измерение ионного обмена на везикулах тонопласта
2.13. Электрофорез белков в ПААГ с SDS
2.14. Вестерн блоттинг HvNHX
2.15. Экспрессия HvNHX2 в ооцитах гладкой шпорцевой лягушки (Xenopus laevis L.)..
2.15.1. Синтез полной копии кДНК HvNHX
2.15.2. Клонирование полной копии кДНК HvNHX2 в плазмиде pT7TS
2.15.3. Синтез мРНК in vitro
2.15.4. Подготовка ооцитов и их микроинъекция мРНК
2.15.5. Определение степени закисления (pH) внешней среды, происходящего в результате работы HvNHX2 в мембранах ооцитов
2.15.6. Выделение микросомальной фракции ооцитов
2.16. Иммунохимическая локализация HvNHX2 в клетках корней проростков ячменя.
2.17. Экспрессия кДНК гена HvNHX2 в растениях Arabidopsis thaliana L. и оценка солеустойчивости трансгенных растений
2.18. Реактивы
2.19. Статистика
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Идентификация кДНК гена вакуолярного Ыа+/Н+-антипортера ячменя
3.1.1. Анализ структуры белка НуННХ
3.1.2. Филогенетический анализ
3.2. Исследование экспрессии ЯуЯЯУ2 в различных органах растений ячменя
3.3. Исследование внутриклеточной локализации белка Ну1ХНХ
3.4. Экспрессия гена НуИНХ2 в ооцитах гладкой шпорцевой лягушки (Хепорич 1ае1н Ь.) и подтверждение ЫаТТГ-обменной функции белка НуЫНХ
3.5. Изучение действия антител против НуГч[НХ2 на 1Ча /Н -обменную активность везикул гонопласта
3.6. Исследование экспрессии ЯгАЯХ2 в корнях и надземной части проростков ячменя контрастных сортов при солевом стрессе
3.7. Изучение количественных изменений НуМНХ2 в вакуолярных мембранах проростков ячменя контрастных сортов при солевом стрессе
3.8. Иммунохимическая локализация НуЫНХ2 в клетках корней проростков ячменя двух сортов
3.9. Экспрессия кДНК гена НхМНХ2 в растениях Arabidopsis (каПапа Ь. и оценка солеустойчивости трансгенных растений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Табл. 1.4. Изменение экспрессии генов №+/Н+-антипортеров растений в ответ на разные стрессы
Ген mPHK
сорбит АБК KCl NaCl белок
AtSOSl [Shi et al. 2000] - -> - t -
AtNHXl [Gaxiola et al. 1999] - - t t -
OsNHXl [Fukuda et al. 1999] - - - t -
AgNHXl [Hamada et al. 2001] t - - t t
AtNHXl [Shi & Zhu 2002] - t t t -
LeNHX2 [Venema et al. 2003] - t - t -
HvNHXl [Fukuda et al. 2004a] t - - t -
AtNHXl,2,5 [Yokoi et al. 2002] t f - t -
ZmNHXl-6 [Zorb et al. 2005] - - - корни T -
листья -
GhNHXl [Wu et.al. 2004] - - - t -
BvNHXl [Xia et al.2002] - - - t t
Примечание: —» отсутствие изменений;Т увеличение; — не определяли.
О количественных изменениях белка Ха+/Н*-антипортера при стрессах имеются пока немногочисленные данные. Тем не менее, показано, что количество вакуолярного Na^H*-антипортера AgNHXl и BvNHXl возрастает при солевом стрессе (NaCl), что, видимо, можно объяснить увеличением накопления транекриптов соответствующего гена при солевом стрессе (табл. 1.4). Увеличение количества белка Ма+/1Т-антипортера при солевом стрессе наблюдалось также в клетках дрожжей [Nass & Rao 1998], что говорит, вероятно, о сходной регуляции экспрессии Na+/H+-антипортеров эукариот.
Наиболее детально изучены б изоформ арабидопсиса [Yokoi et al. 2002]. Доминирующие изоформы AtNHXl и AtNHX2 присутствуют в корнях, надземной части и проростках. Уровень экспрессии AtNHX3, 4 и 6 в этих тканях гораздо ниже. Показано, что экспрессия AtNHXl увеличивается в листьях, но не в корнях, под действием NaCl или АБК [Quintero et al. 2000]. В проростках AtNHXl и AtNHX2 индуцируются солевым стрессом, гиперосмотическим шоком и при добавлении АБК, а экспрессия AtNHX5 индуцируется только под действием солевого стресса [Blumwald et al. 2000]. AtNHXl и AtNHX2 не индуцировались в мутантах с нарушенным синтезом АБК при добавлении NaCl, что позволяет сделать вывод о роли АБК-сигнального пути в регуляции экспрессии