Идентификация в растении Thellungiella salsuginea генов TsABF и Ts14-3-3, анализ взаимодействия кодируемых ими белков

• Автор: Высоцкий, Денис Александрович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Функции генов, регулируемых действием абиотического стресса
1.2. Ключевые элементы сигнальных каскадов, возникающих при абиотическом стрессе
1.3. Гормональный ответ при абиотическом стрессе
1.4. Регуляция транскрипции генов при абиотическом стрессе
1.5.Факторы транскрипции АБК-независимого пути передачи сигнала
1.6.Факторы транскрипции АБК-зависимого пути передачи сигнала
1.7. факторы транскрипции ABF/AREB как ключевой элемент регуляции АБК-зависимой экспрессии генов
1.7.1. ABRE как главный cis-элемент регуляции АБК-зависимой экспрессии генов
1.7.2. ABF/AREB как подсемейство факторов транскрипции bZIP
1.7.3. Структура белков ABF/AREB
1.7.4. Особенности экспрессии и функции ABF/AREB факторов транскрипции
1.7.5. Модификация функций факторов транскрипции ABF/AREB, регуляция их активности
1.8. Регуляторные белки 14-3-3, их место в сигнальной трансдукции
1.8.1. История открытия, номенклатура белков 14
1.8.2. Структура и функции белков 14
1.9. Заключение
Материалы и методы
2.1. Биологический материал
2.2. Выделение РНК и синтез первой цепи «ДНК
2.3. Определение концентрации нуклеиновых кислот
2.4. Полимеразная цепная реакция и электрофорез фрагментов ДНК
2.5. Приготовление компетентных клеток
2.6. Клонирование ПЦР-продуктов методом TA-cloning
2.7. Идентификация генов 14-3-3 и ABF в растениях Thelungiella
2.8. Измерение экспрессии генов ABFh 14-3-3 в растениях Arabidopsis и Thellungiella
2.8.1. Получение растительного материала
2.8.2. ОТ-ПЦР в реальном времени
2.3.3. Измерение тканеспецифичной экспрессии
2.9. Дрожжевой двугибридный анализ
2.9.1. Качественная оценка взаимодействия белков 14-3-3 с ABF факторами транскрипции..

2.9.2 Количественная оценка интенсивности взаимодействия белков 14-3-3 с АВР факторами
транскрипции
РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Идентификация генов АВР и 14-3-3 в ТИе11ип§1е11а
3.1.1. Идентификация генов АВР
3.1.2. Идентификация генов 14
3.2. Анализ экспрессии генов АВР и 14-3-3 в ТИе11ип§1е11а
3.2.1. Анализ экспрессии генов АВР в разных экотипах Thellungiella под воздействием солевого стресса
3.2.2. Оценка орган-специфичности экспресси генов 14-3-3 в растениях ТИе11ипя1е11а
3.2.3. Анализ экспрессии генов 14-3-3 в нормальных условиях и в ответ на стрессовые воздействия
3.3. Анализ возможного взаимодействия факторов транскрипции АВР с регуляторными белками 14
3.3.1. Качественная оценка взаимодействия факторов транскрипции АВР с белками 14-3-3 .
3.2.2. Количественный анализ интенсивности взаимодействия факторов транскрипции АВР с белками 14
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ABF - ABRE-binding factor (ABRE-связывающий фактор)
AREB - ABA-responsive element binding factor
АР2 - APETALA
bZIP - Basic region/leucine zipper motif (основной домен/ лейциновая
молния)
LEA - Late embryogenesis abundant (преобладающие белки позднего
эмбриогенеза)
cADPR - Циклическая АДФ-рибоза
CBF - С-repeat binding factor
CDPK - Са2+-зависимая протеинкиназа
СЕ - Coupling element (сопряженный элемент)
СІРК - CBL-взаимодействущая протеинкиназа
CRT - C-repeat
DRE - Dehydration-responsive element
DREB - DRE-binding protein
EST - Expressed sequence tag (маркер экспрессирующейся
последовательности)
ERF - Etheylene-responsive element-binding factor
GF14 - G-box Factor 14
GRF - General Regulatory Factor
IPs - Инозит-1,4,5-трифосфат
ІРб - Инозитол гексафосфат
IPTG - Изопропил-р-О-тиогалактозид
NAC - NAM, ATAF и CUC факторы транскрипции
NCBI - Национальный центр биотехнологической информации
SnRK2 - SNF1-подобные киназы 2 типа
SOS - Salt overly sensitive
МАРК - Митоген-активируемая протеинкиназа
PP2C - Протеинфосфатаза 2С-типа
X-Gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-Б-галактопиранозид
ZFP - Белки с доменом «цинковые пальцы»
АБК - Абсцизовая кислота
АФК - Активные формы кислорода
ЖК - Жасмоновая кислота
ОНФГ - Орто-нитрофенил-Р-Б-галактопиранозид
CK - Салициловая кислота

1.8.2. Структура и функции белков 14
Все белки 14-3-3 обладают высококонсервативным ядром, состоящим из
9 а-спиралей, формирующих амфифильный желоб, в который попадают
связываемые ими белки мишени. Белки 14-3-3 формируют жестко
сцепленные гомо- или гетеродимеры, образующие двойной желоб, как
показано на рисунке 7.
Рисунок 7. Трехмерная модель димера 14-3-3. Н1-Н9 - а-спирали, N,C - концевые области (Obsil and Obsilova 2011)
Наиболее вариабельными участками данных белков являются их N- и С-концевые части. С-концевой домен располагается сверху образованного центральными спиралями желоба и может служить своего рода замком, накрывающим связываемый белок. Опираясь на определенные предпосылки и экспериментальные данные, предполагается, что вариабельные С-концевые фрагменты белков 14-3-3 могут отвечать за специфичность взаимодействия с белками-мишенями (Shen et al. 2003; Bomke 2005; Visconti et al. 2008). Димеризация белков 14-3-3 происходит за счет взаимодействия N-концевых а-спиралей (Ferl et al. 2002).
В ходе ряда исследований были выявлены типичные мотивы, с которыми связываются белки 14-3-3. Так, в более ранней литературе (Yaffe et al. 1997), обозначали 2 консенсусных мотива, мотив I типа RtS/ф][+][PS/pT]XP и мотив II типа RX[S/